柔嫩艾美耳球蟲A08與棒狀體蛋白的單抗制備及酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建.pdf

1、柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella ）是雞的一種重要的寄生蟲，可引起雞只嚴重的腸道病變和死亡，使養(yǎng)雞業(yè)遭受重大損失。柔嫩艾美耳球蟲主要的致病階段在蟲體對宿主細胞的入侵，該過程涉及到多種與入侵相關(guān)的因子。本研究以柔嫩艾美耳球蟲為研究對象，進行了柔嫩艾美耳球蟲A08 蛋白（EtA08 ）和棒狀體蛋白（EtRp）的單克隆抗體（Monoclonal antibody, McAb ）制備，并構(gòu)建了EtA08的畢赤酵母（Pichia p

2、astoris ）表達系統(tǒng)，以期為深入探索這些入侵相關(guān)因子的作用機理，開發(fā)新的控制雞球蟲病的方法提供有價值的實驗依據(jù)。
　　 1. EtA08和EtRp單克隆抗體的制備與鑒定
　　 利用原核表達的EtA08和EtRp的重組蛋白免疫BALB/c 小鼠，經(jīng)4 次免疫后取脾臟制備免疫脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 融合，經(jīng)間接ELISA和Western blot 篩選獲得2 株抗EtA08 蛋白的特異性雜交瘤細胞株，分別命

3、名為1G7和4F11 ；獲得1 株抗EtRp的特異性雜交瘤細胞株，命名為2E3。染色體分析表明，3 株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目都在94～108 之間。亞類鑒定顯示，McAb 1G7和2E3亞類為IgG2a，4F11亞類為IgM。效價測定顯示，1G7、4F11、2E3 細胞上清效價分別為1:1.6×10 5、1:64、1:40，小鼠腹水效價分別為1:1 ×10 6、1:1.02 ×10 5、1:2.56 ×10 4。同時，試驗利用McAb2

4、E3 對EtRp在E. Tenella 子孢子中的分布進行分子定位，結(jié)果顯示該蛋白主要分布于子孢子的頂端；而當子孢子在DMEM 培養(yǎng)基中41 ℃孵育1 h后，該蛋白則分布于整個蟲體。入侵抑制試驗顯示，McAb 2E3 對子孢子入侵體外培養(yǎng)的DF-1 細胞的抑制率達63.5%，說明EtRp在蟲體入侵宿主細胞過程中起重要作用。
　　 2. EtA08基因畢赤酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建
　　 根據(jù)文獻設(shè)計一對特異性引物，以A08 蛋白

5、cDNA 為模板擴增出1 083 bp的目的基因片段，將該基因連接到pGEM-T-easy 載體上，序列測定和雙酶切鑒定表明A08基因克隆成功。用EcoR I和Not I 酶切回收目的片段連接至用同樣酶切的真核表達載體pPIC9k 上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9k-A08，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定正確后用Sac I 將重組質(zhì)粒線性化，再電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115 菌株，G418 篩選抗性重組子，經(jīng)PCR 鑒定正確重組子