應用基因隨機突變提高雞柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2蛋白質免疫原性的研究.pdf

1、雞球蟲病是一類由專性細胞內寄生的艾美耳球蟲引起的腸道原蟲疾病。據(jù)估計每年全世界用于預防和治療球蟲病成本會超過30億美元，中國每年約有30多億人民幣。目前球蟲病的防控主要依靠藥物與疫苗，隨著耐藥蟲株的出現(xiàn)和針對抗球蟲藥物的立法限制，人們更加重視免疫預防。市場上的疫苗主要為多種雞艾美耳球蟲活卵囊的混合，具有很好的免疫保護效果，但是由于活疫苗存在安全問題以及較高的生產(chǎn)成本，研究者們將更多的精力用于以亞單位為基礎的新型分子疫苗的研制。
　

2、　新型分子疫苗研制依靠具有較好抗原性以及免疫原性的抗原，由于球蟲復雜的抗原結構以及生活史，抗原鑒定的難度以及抗原免疫原性篩選的限制阻礙了亞單位疫苗研制的進展。研究者們也開展了大量的研究來改善抗原的免疫保護效果，包括新佐劑的研制，益生菌誘導的非特異性免疫等，但是這些都不能從根本上改善抗原的免疫原性。因此，改善已有疫苗可能是一個快速和有效的方法。
　　定向進化被廣泛用于蛋白質工程領域，其中重要的應用之一就是改善抗原的免疫原性。關鍵氨基

3、酸的改變對于抗原的免疫反應和免疫識別有很大影響，比如可逆抑制宿主的免疫反應、影響T細胞的激活、改善蛋白質免疫原性等，使用隨機突變構建基因突變庫是定向進化常用的方法之一。
　　EtMIC家族蛋白質在球蟲移行、入侵宿主細胞以及胞內生存方面有重要的作用，EtMIC2蛋白質能夠在柔嫩艾美耳球蟲的整個生活周期內都表達，研究表明EtMIC2基因或者蛋白質能夠誘導部分免疫保護反應，是很好的疫苗候選抗原。使用隨機突變技術針對EtMIC2進行定向進

4、化，建立基因突變庫，使用酵母表面展示技術結合FACS以及動物免疫保護試驗篩選目的變異蛋白質，從而改善EtMIC2蛋白質的免疫原性，為球蟲疫苗的研制提供基礎。
　　1.EtMIC2基因變異庫的構建
　　以未突變的EtMIC2基因為模板，使用epPCR進行擴增，獲得約33μg的epPCR產(chǎn)物，與T1克隆載體連接后轉入大腸桿菌細胞內。經(jīng)323個氨芐抗性的瓊脂平板篩選，獲得107個E coli單克隆。挑取每個平板上的20個單菌落進行

5、PCR鑒定，6460個菌落中有5782個顯示為陽性，陽性率達到89.5％。為分析epPCR的突變頻率以及突變在基因中的分布，隨機選擇了陽性克隆中的21變異EtMIC2基因進行序列鑒定，經(jīng)比對分析在951bp的變異基因中平均出現(xiàn)了6.86±3.21個突變位點，編碼的蛋白質有4.19±2.68個氨基酸突變，而且突變位點在EtMIC2基因中隨機分布，與我們之前的試驗設計一致，結果證明EtMIC2基因突變庫構建成功。
　　2.EtMIC2

6、蛋白質變異庫的構建
　　PCR擴增基因突變庫中的EtMIC2片段，與pCTCON2質粒進行雙酶切后連接并轉染釀酒酵母EBY100，涂布SD-CAA篩選平板，獲得大約為108個酵母克隆。經(jīng)誘導表面展示后，以兔源抗EtMIC2蛋白質多抗作為一抗，F(xiàn)ITC標記的鼠抗兔IgG單抗作為二抗標記展示的變異蛋白質，使用免疫熒光檢測蛋白的表達情況。利用100mMDTT還原Aga1p和Aga2p之間的二硫鍵，游離表面展示的變異蛋白，使用兔源抗EtM

7、IC2蛋白質多抗進行Western blot鑒定，結果顯示EtMIC2變異蛋白質庫成功展示于酵母細胞表面。
　　3.EtMIC2蛋白質變異庫的篩選
　　使用流式細胞分選儀對酵母表面展示的蛋白質突變庫進行篩選，基于抗原抗體反應親和力的強弱為篩選條件設三個篩選門（P1，P2和P3），經(jīng)過三次連續(xù)的篩選從108個進樣酵母菌中收集到401個具有不同熒光信號強度的細胞。將篩選的酵母菌涂布固體篩選SD-CAA平板，培養(yǎng)后獲得19個酵母克

8、隆菌落。為獲得變異EtMIC2的基因序列，提取酵母菌中的重組質粒，經(jīng)PCR擴增與T1載體連接后測序。經(jīng)分析19個突變株中有5株蛋白質的氨基酸序列未發(fā)生突變，6株蛋白質出現(xiàn)終止密碼子，剩余7株變異EtMIC2蛋白質分別有2，3，4，6，8，11和14個突變氨基酸。同時使用免疫熒光以及流式細胞儀檢測19株變異蛋白質的熒光信號，并分析了與氨基酸突變的關系。
　　4.變異EtMIC2蛋白質抗球蟲感染的保護效果評價
　　將EtMIC2

9、以及7種變異基因克隆至pET30a表達質粒并轉化大腸桿菌，經(jīng)誘導表達以及純化后獲得高純度的蛋白質，并使用鼠源抗His標簽單抗進行Western blot進行鑒定。將變異蛋白質與弗氏佐劑乳化后制作亞單位疫苗，在雛雞7和14日齡時進行頸部皮下多點注射免疫兩次，二免后七天除不免疫不感染球蟲組(PBS-Ⅰ)外皆接種30，000個柔嫩艾美耳球蟲卵囊。結果顯示相對于不免疫感染球蟲組(PBS-Ⅱ)，各蛋白免疫組的體重增長升高顯著，卵囊排出以及病變積分

10、均有顯著性的降低(P＜0.05)。與未突變的蛋白質免疫組相比，1130，2119以及2118組中盲腸病變記分以及1130組糞便的卵囊排出均顯著降低，ACI結果顯示1130和2119組變異蛋白質能夠提供良好的保護力，而且2119以及1130免疫組的淋巴細胞針對EtMIC2和EtMIC2變異蛋白質的刺激后的增殖效果，感染球蟲后第10天外周血淋巴細胞中CD4+和CD8+的比例，以及感染球蟲第0，10天盲腸黏膜中的sIgA的抗體水平都顯著增高(