雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗的研究.pdf

1、近10多年來,雞球蟲病的免疫預(yù)防研究越來越受到人們的重視.尋找免疫原性好的保護(hù)性抗原,是完成基因工程苗和核酸疫苗研究的前提.微管是球蟲的一種重要的細(xì)胞器,在球蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中起著重要作用,該論文以E.acervulina的微管蛋白為研究對象,進(jìn)行了如下試驗(yàn):1.E.acervulina α-微管蛋白基因的克隆以E.acervulina BJ株孢子化卵囊總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR,按照Genebank上發(fā)表的α-微管蛋白基因的序

2、列(Yamage M,1995)設(shè)計(jì)引物,上、下游引物分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn),擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選,將PCR和酶切鑒定正確的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序.結(jié)果表明,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1955bp,與Yamage M(1995)在Genebank上登錄的α-微管蛋白基因的同源性為97.4﹪.此基因現(xiàn)已作為E.acervulina BJ株的α-微管蛋白基因登錄到Genebank上,

3、登錄號是AY488134.2.α-微管蛋白基因的表達(dá)及鑒定重新設(shè)計(jì)表達(dá)引物,以陽性質(zhì)粒為模板,克隆α-微管蛋白基因的閱讀框,與pGEX-6P-1載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌,用1.0mM IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后2h蛋白表達(dá)量即達(dá)到較高的水平,5h達(dá)到高峰,表達(dá)蛋白的分子量為69kDa,波層掃描分析表達(dá)蛋白占菌體蛋白的33﹪.用GST抗體進(jìn)行Western-blot檢測,成功檢測到特異性

4、條帶.3.α-微管蛋白真核表達(dá)載體(p-α-tubulin)的構(gòu)建將微管蛋白基因的ORF片段插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中,構(gòu)建成核酸疫苗pcDNA3.1-α-tubulin(p-α-tubulin),經(jīng)酶切和PCR鑒定為正確插入.4.α-微管蛋白亞單位疫苗和核酸疫苗的免疫保護(hù)效果研究核酸疫苗和亞單位疫苗分別設(shè)高(100μg)、中(50μg)、低(25μg)三個(gè)劑量組,同時(shí)設(shè)地克珠利藥物組、活卵囊組、紅對照組和空白對照組,在雞只7