雞堆型艾美耳球蟲裂殖子單鏈抗體可變區(qū)基因文庫的構(gòu)建.pdf

1、雞球蟲病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害程度十分嚴(yán)重，全世界每年因雞球蟲病造成的損失超過20億美元。最近的研究證明主要由堆型艾美耳球蟲感染引起的亞臨床型球蟲病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成的損失有時(shí)要比臨床型球蟲病大的多，因此對(duì)堆型艾美耳球蟲進(jìn)行專門詳盡的深入研究是非常必要的。本文建立了針對(duì)雞堆型艾美耳球蟲裂殖子抗原的鼠源抗體基因文庫，并對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定。 本試驗(yàn)利用單卵囊分離技術(shù)從雞場分離了四株純種艾美耳球蟲卵囊，經(jīng)增殖純化后，提取卵囊基因組DNA，用特異性引

2、物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示其中兩株為純種雞堆型艾美耳球蟲。將增殖的卵囊接種無球蟲感染的健康雛雞，確定提取裂殖子的最佳時(shí)間為接種后56小時(shí)；并進(jìn)行第二代裂殖子的提取純化試驗(yàn)。純化的裂殖子經(jīng)超聲裂解，高速離心，取上清，得到裂殖子可溶性抗原。將提取的堆型艾美耳球蟲裂殖子可溶性抗原與等量佐劑乳化，免疫BALB/C小鼠。采取免疫小鼠的血液，制各陽性血清，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA方法檢測抗體效價(jià)，取抗體效價(jià)高的小鼠作為脾臟供體。提取脾臟

3、的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳證明小鼠脾細(xì)胞總RNA提取成功。以提取的RNA為模板，利用引物Oligo(dT)<,15>合成cDNA。根據(jù)小鼠抗體可變區(qū)的恒定區(qū)的氨基酸序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增鼠抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的兼并引物，并以cDNA為模板，擴(kuò)增出輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)基因的大小約390bp，重鏈可變區(qū)基因在420bp左右。從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段，用回收試劑盒回收輕鏈、重鏈可變區(qū)，經(jīng)瓊脂糖凝膠