山東地區(qū)水貂綠膿桿菌分離鑒定、耐藥性檢測及ToxA基因的克隆表達(dá).pdf

1、本試驗從山東各地暴發(fā)的水貂出血性肺炎的病例中分離出15株疑似綠膿桿菌的病菌，通過生理生化鑒定以及分子生物學(xué)鑒定確定為綠膿桿菌;然后對15株綠膿桿菌進(jìn)行血清型分離，血清型鑒定結(jié)果表明山東省地區(qū)水貂群中流行G型、B型、E型三種血清型致病性綠膿桿菌，其中G型為山東地區(qū)主要流行血清型，占分離菌株的80％。
　　 本試驗對分離的15株綠膿桿菌進(jìn)行了藥敏試驗，結(jié)果顯示山東地區(qū)水貂綠膿桿菌對10種藥物已普遍產(chǎn)生耐藥性，其中對復(fù)方新諾明、四環(huán)素

2、、頭孢膚肟和羧芐青霉素四種藥物耐藥性最強(qiáng)，多數(shù)菌株表現(xiàn)為0抑菌環(huán);其次對近年來在養(yǎng)貂業(yè)中普遍應(yīng)用的慶大霉素和菌必治的耐藥性也很強(qiáng)，而對丁胺卡那霉素、復(fù)達(dá)欣、先鋒必素、環(huán)丙沙星等四種藥物普遍敏感。
　　 本試驗通過PCR技術(shù)，以本實驗室分離到的綠膿桿菌的染色體DNA為模板，擴(kuò)增表達(dá)外毒素A蛋白的ToxA基因，將產(chǎn)物克隆與pMD-18T載體連接，鑒定后測序。利用DNASTAR軟件將測定的12株序列與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒株P(guān)A1

3、03株和PA01株toxA基因序列進(jìn)行比較，繪制toxA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明PA2、PA3、PA4、PA7、PA8、PA9、PA10、PA11與PA103、PA01遺傳關(guān)系較近，PA11與PA01遺傳關(guān)系最近，PA1、PA5、PA6與PA103、PA01遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，PA12與PA103、PA01遺傳關(guān)系相對遠(yuǎn)。通過toxA基因序列比較，可得知目前山東地區(qū)流行的水貂綠膿桿菌的有關(guān)外毒素A毒性的氨基酸均未發(fā)生突變，推斷菌株細(xì)胞毒沒有降

4、低，且流行株變異不大。
　　 本試驗根據(jù)Genebank上報道的綠膿桿菌ToxA基因序列設(shè)計引物，在引物的上下游分別帶有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點。以本實驗室分離到的綠膿桿菌的染色體DNA為模板，經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增出約1917bp的片段，按常規(guī)方法克隆到pMD-18T裁體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和酶切分析獲得陽性重組質(zhì)粒，并提取質(zhì)粒。用相同的限制性內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體pET32a和重組質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-ToxA，并轉(zhuǎn)入E