共表達(dá)H5N1亞型HPAIV HA、NA基因DNA疫苗構(gòu)建及免疫效力評估.pdf

1、眾多研究表明，基于禽流感HA基因所研制的基因工程病毒活載體疫苗、亞單位疫苗或核酸疫苗均可對同一HA亞型病毒的攻擊產(chǎn)生近100％的保護，而對異源病毒的攻擊保護性較差。鑒于禽流感病毒的抗原性是不斷變化的，理想的禽流感疫苗需要考慮到它對不同亞型病毒的保護性如何，HA作為AIV的重要的結(jié)構(gòu)蛋白恰好具有彌補HI缺陷的某些優(yōu)點，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異中和抗體。因此，如果能利用其這一特性研制DNA疫苗將為禽流感的免疫預(yù)防帶來極大的方便。 為了研

2、究HA、NA基因DNA疫苗，我們用PCR從質(zhì)粒pBDNA中擴增A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]NA基因；以含CMV啟動子—增強子的pCI，含雞β-actin啟動子表達(dá)載體pCAGGS分別構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCINA和pCANA.再用pCANA分別與質(zhì)粒pCIoptiHA、pCAoptiHA構(gòu)建雙順反子表達(dá)質(zhì)粒pCIH5N1、pCAH5N1，其中optiHA基因和NA基因都位于各自的強啟

3、動子和增強子下，且都帶有獨立的Poly(A)終止序列，從而保證了此DNA疫苗中的兩個基因都能獨立表達(dá)。此項研究為開展雞禽類免疫實驗和免疫藥劑效能的評估奠定了基礎(chǔ)。 將構(gòu)建質(zhì)粒pCINA、pCANA、pCIoptiH5N1和pCAoptiH5N1分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后的48小時293T細(xì)胞；另外以Westermblot檢驗上述四種質(zhì)?？煞謩e表達(dá)相應(yīng)的HA、NA蛋白。結(jié)果表明：本試驗成功構(gòu)建了表達(dá)優(yōu)化的HA基因

4、和NA基因的DNA疫苗質(zhì)粒pCANA、pCINA、pCAoptiH5N1和pCIoptiH5N1，體外瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后用間接免疫熒光及Westernblot方法均檢測到了相應(yīng)的HA、NA蛋白表達(dá)產(chǎn)物，并具有生物活性。 為進一步評估不同免疫源基因構(gòu)建DNA疫苗單獨、聯(lián)合使用對SPF免疫雞形成免疫保護效果，以10μgpCIoptiHA、pCAoptiHA、pCIoptiHA+pCANA、pCAoptiHA+pCANA、pCIo

5、ptiH5N1、pCAoptiH5N1、pCANA的免疫劑量分別肌肉注射免疫3周齡SPF雞，對照雞則以PBS肌肉注射免疫。首次免疫3周后以相同劑量和途徑加強免疫，加強免疫后2周分別用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)、A/FPV/Rostock/34(H7N1)鼻腔感染攻毒，觀察發(fā)病與死亡情況，分別于攻毒后第3、5、7采集喉頭及泄殖腔拭子進行病毒分離、滴定檢測排毒情況，同時檢測免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗體的動態(tài)變

6、化。 以100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)攻擊實驗結(jié)果：除對照組和pCANA外，所有免疫組在加強免疫后攻毒前HI抗體轉(zhuǎn)陽，并且HI抗體水平都大于5log2。10μg劑量免疫，pCIoptiHA、pCAoptiHA可對免疫雞形成100％完全保護，不發(fā)病，不死亡，但有較多免疫雞排毒；10μg劑量免疫，pCAoptiHA+pCANA可對免疫雞形成100％完全保護，并且不發(fā)病、不致死、不排毒；10μg劑量免疫，pCIo

7、ptiHA+pCANA、pCAoptiH5N1、pCIoptiH5N1也能對免疫雞形成100％完全保護，不發(fā)病、不死亡，只有個別免疫雞出現(xiàn)排毒情況。10μg劑量免疫，pCANA形成部分免疫保護，但排毒免疫雞數(shù)量多。實驗證明了HI抗體在免疫保護中的主導(dǎo)作用，NI抗體在HI抗體存在的條件下，才明顯表現(xiàn)出增強免疫保護效果的作用。 以100LD50的HPAIVA/FPV/Rostock/34(H7N1)攻擊實驗結(jié)果：單基因DNA疫苗pC

8、AoptiHA不能提供任何免疫保護；10μg劑量的pCIoptiHA+pCANA、pCAoptiHA+pCANA、pCIoptiH5N1、pCAoptiH5N1和pCAoptiNA均形成不完全免疫保護。其中保護率最高的是pCIoptiH5N1達(dá)75％，10μgpCANA保護率最低為12.5％。實驗還表明HI(H5)和NI抗體的同時存在有助于免疫保護率的提高和免疫雞排毒陽性率降低，盡管HI抗體在H5亞型(免疫原基因)與H7亞型(攻毒HPA

9、IV)之間不存在任何交叉保護。攻毒后兩周，部分存活免疫雞中不能檢測到H7亞型HI抗體的存在，說明這些雞只未曾感染H7HPAIV。 實驗結(jié)果表明：用所構(gòu)建的DNA疫苗免疫SPF雞后，不僅針對H5亞型HPAIV免疫保護效果在原有DNA疫苗pCIoptiHA、pCAoptiHA基礎(chǔ)上有所提高，而且還可以部分保護其他N1亞型HPAIV的攻擊，是具有市場潛力的優(yōu)良疫苗候選株。動物實驗除了證明NI抗體在誘導(dǎo)免疫雞只產(chǎn)生免疫保護中也同樣具有重