TGEV S基因、N基因雙順反子DNA疫苗的構建研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要腸道傳染病，該病毒的N、S蛋白可誘導機體產生特異性抗體。應用雙啟動子表達載體制備多價核酸疫苗在基因免疫的研究中具有重要意義，通過構建雙表達載體的方法將TGEV的S和N基因聯(lián)合應用是一種有效且簡便易行的方法。本研究以pVAX1為基礎構建了通用的雙啟動子表達載體pVAXD；將TGEVS基因主要抗原位點片斷Sa和N基因同時插入pVAXD，構建了真核雙順反子

2、表達載體pVAXD-N-Sa，對其免疫原性進行了初步研究。 1.真核雙啟動子表達載體pVAXD的構建通過對載體pVAX1，多克隆位點的改造，分別構建出pVAXA和pVAXB。用PCR方法從載體pVAXA上擴增含-PCMV-MCS-BGHpolyA-的表達單元片段，插入pVAXB，組裝成雙啟動予表達載體pVAXD。在pVAXD中分別插入DsRed和EGFP基因，構建單表達質粒pVAXD-DsRed和pVAXD-EGFP，再在pVA

3、XD-DsRed中插入EGFP基因構建雙表達質粒pVAXD-EGFP-DsRed。將以上重組質粒轉染COS-7細胞進行瞬時表達，用熒光顯微鏡觀察，結果雙表達質粒與單表達質粒相比同一種熒光蛋白表達強度無明顯差異，且雙表達質粒pVAXD-EGFP-DsRed中兩種熒光蛋白間表達強度相當。結果表明載體pVAXD構建成功，能夠同時表達兩個外源基因。本實驗構建的雙啟動子載體為進行基因表達的研究提供了新的工具，并為雙價DNA疫苗的研制和提高核酸疫苗

4、免疫效率的研究奠定基礎。 2.TGEV雙順反子核酸疫苗pVAXD-N-Sa的構建分別從pMD19T-Sa、pMD19T-N上擴增S基因主要抗原位點片斷Sa和N基因。將TGEVSa片斷和N基因分別插入載體pVAXD中，構建出單表達質粒pVAXD-Sa和pVAXD-N。在pVAXD-Sa上插入N基因構建出雙表達質粒pVAXD_N-Sa。將重組質粒分別轉染COS-7細胞進行表達，通過RT-PCR法檢測表達情況。結果pVAXD-Sa和p

5、VAXD-N組能分別擴增出約2.1kb和1.2kb的條帶，而pVAXD-N-Sa組能同時擴增出1.2kb和2.1kb的兩條帶，從而從mRNA水平證實在載體pVAXD-N-Sa中N基因和sa片斷得到了共表達，初步實現(xiàn)了N和Sa的體外共表達。 3.TGEV雙順反子核酸疫苗pVAXD-N-Sa免疫原性的初步研究將重組質粒pVAXD-Sa、pVAXD-N、pVAXD-N-Sa以及混合質粒pVAXD-N+pVAXD-Sa免疫小鼠，用ELI

6、SA方法檢測小鼠抗體水平變化。pVAXD-Sa、pVAXD-N-Sa、DVAXD-Sa+pVAXD-N組在首免后第14d可檢測到抗TGEV陽性抗體，并且在第35d出現(xiàn)高峰。pVAXD-N在首免后第28天檢測到抗TGEV陽性抗體，在第42d出現(xiàn)高峰。同時還發(fā)現(xiàn)pVAXD-N-Sa和DVAXD-Sa+DVAXD-N免疫組誘導的ELISA抗體水平高于pVAXD-Sa和pVAXD-N免疫組，而雙表達組與混合質粒組間無明顯差異。結果表明，重組真核