多基因雙T-DNA植物表達載體的構建及擬南芥遺傳轉化.pdf

1、20世紀80年代以來，以轉基因技術為代表的植物基因工程技術的廣泛應用為植物的遺傳改良開拓了廣闊的前景。傳統(tǒng)的轉基因植物絕大多數是通過單個目的基因的遺傳轉化而獲得的。長期以來，培育具有多種優(yōu)良品質，如高產、優(yōu)質、高抗、多抗或具備其他生產上有用的特性的作物品種一直是科學家進行植物遺傳改良的共同愿望。為此，多基因組裝與轉化技術便應運而生，以便將多個目的基因導入到植物基因組中并在植物中進行表達。其策略之一即為構建多基因植物表達載體。 在

2、大力發(fā)展農業(yè)基因工程的同時，用以有效篩選轉基因植物的選擇標記基因(如抗生素抗性基因，除草劑抗性基因等)的使用卻引發(fā)了人們對轉基因植物安全性的隱憂。因此，培育具有安全選擇標記基因或無選擇標記基因的轉基因植物已成為基因工程亟待解決的問題。其中雙T-DNA系統(tǒng)是實現篩選完成后選擇標記基因刪除的一種簡便可行的策略。 本研究以質粒pCAMBIA1300為骨架，利用DNA重組技術，構建了一個多基因雙T-DNA植物表達載體：2T-bbgdD。

3、該載體含有兩個T-DNA區(qū)：第一個T-DNA區(qū)含有CaMV35S啟動予啟動的抗性基因DREB1A、hsp熱誘導啟動子啟動的抗性基因Na<'+>依賴性Pi轉運體基因(簡稱為d5基因)和CaMV35S啟動子啟動的報告基因gfp；第二個T-DNA區(qū)含有玉米泛素ubiquitin基因啟動子啟動的抗性基因betA和花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S promoter)啟動的抗除草劑基因bar。通過酶切鑒定，證明構建的植物表達載體與預期設計

4、的一致。 利用農桿菌介導法將該載體轉入模式植物擬南芥中，通過對T<,1>代轉基因植株進行PCR檢測，證明這兩個T-DNA區(qū)內的五個基因(第一個T-DNA區(qū)內的三個目的基因和第二個T-DNA區(qū)內的兩個目的基因)及其各自的調控元件能共整合進T<,1>代轉基因擬南芥的基因組中。對于不同的多基因共轉化的T<,1>代轉基因擬南芥株系，由于T-DNA區(qū)插入方式各異，因此在T<,2>代轉基因植株中，兩個T-DNA區(qū)既可能由于連鎖遺傳而共整合進

5、同一轉基因植株的基因組中，從而實現多基因的共轉化：也可能由于發(fā)生分離而分別整合進不同的轉基因植株的基因組中，從而實現選擇標記基因與另一個T-DNA區(qū)所含的三個基因的分離。T<,2>代轉基因植株的PCR檢測結果顯示：利用農桿菌介導法將該載體轉化擬南芥，既可獲得多基因共轉化的T<,2>代轉基因擬南芥純系，也可篩選到去除選擇標記基因(bar基因)的T<,2>代轉基因擬南芥。通過模式植物的遺傳轉化研究，表明將本工作構建的多基因雙T-DNA植物表