植物甜蛋白基因Thaumatin表達載體的構(gòu)建及對雪蓮果的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜蛋白(Thaumatin)存在于西非熱帶雨林中一種竹芋科多年生草本(Thaumatococcus daniellii Benth)的果實膠質(zhì)假種皮中。Thaumatin蛋白有甜味,而且它還具有低熱量、安全無毒、甜味純正及可被降解為體內(nèi)所需氨基酸等優(yōu)點,是一類高甜度而又不含糖的新型甜味劑,所以它被認為有希望發(fā)展成為食品工業(yè)中營養(yǎng)性碳水化合物的替代品而成為未來新型的甜味劑。但是T.daniellii在原產(chǎn)地之外不能正常結(jié)實,并且引種不成功

2、難以大量生產(chǎn),致使甜味蛋白成為十分昂貴的商品。生物技術(shù)的迅速發(fā)展啟發(fā)人們用基因重組的手段開發(fā)甜蛋白,對這些甜味蛋白和矯味蛋白進行了克隆和測序,并將其表達于其他宿主。已經(jīng)實現(xiàn)了甜蛋白在微生物中的表達,個別的還在一些植物中得到表達。因此,本試驗在吸取前人經(jīng)驗的基礎上,構(gòu)建了植物表達載體pBI121-Thaumatin,并將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中,然后通過農(nóng)桿菌的介導將Thaumatin基因?qū)胙┥徆?并對轉(zhuǎn)基因植株進行了檢測,借以

3、初步探討甜蛋白在植物中的轉(zhuǎn)化和表達情況,為進一步轉(zhuǎn)化園藝植物打下了基礎。實驗結(jié)果如下:
　　 (1)甜蛋白Thaumatin基因的人工合成和克隆本實驗根據(jù)已報道的Thaumatin基因序列,采用重疊延伸-PCR法人工合成Thaumatin全長基因,與T載體pMD19-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α,通過菌落PCR、雙酶切、測序鑒定,得到克隆載體pMD-Thaumatin。
　　 (2)甜蛋白Thaumatin基因植物表達質(zhì)粒pB1

4、121-Thaumatin的構(gòu)建與鑒定。
　　 利用DNA重組技術(shù),將植物甜蛋白Thaumatin基因克隆至植物表達載體pB1121中,通過PCR、酶切、電泳鑒定Thaumatin基因已成功構(gòu)建到植物表達質(zhì)粒pB1121中。
　　 (3)pB1121-Fhaumatin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒pB1121-Thaumatin通過直接轉(zhuǎn)化法導入農(nóng)桿菌EHA105中,利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)平板篩選陽性克隆,有

5、單菌落生長,經(jīng)過菌液PCR鑒定,證明重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)進農(nóng)桿菌EHA105中。
　　 (4)植株再生體系的建立采用無菌苗雪蓮果(Smallanthus sonchifolius)葉片為外植體,以MS為基本培養(yǎng)基,篩選出MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L,形成愈傷組織,MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L以誘導不定芽的分化,并于1/2MS+NAA0.2mg/L生根培養(yǎng),獲得完整再生植株。
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