奇異果甜蛋白thaumatin基因在玉米中的表達以及thaumatin-PDI二價載體在煙草中表達的研究.pdf

1、奇異果甜蛋白Thaumatin是從一種叫Thaumatococcus daniellii Benth的竹芋科(Marabtaceae)植物的果實中提取出來的.它具有無毒安全、甜度高、熱量低等許多優(yōu)點,是一種新型甜味劑.但由于Thaumatococcus daniellii Benth對生長條件極其苛刻,在原產(chǎn)地之外的地方無法結(jié)實,試圖通過人工栽培Thaumatococcus daniellii Benth大量提取Thaumatin是不可

2、能的,于是人們便把希望寄托在thaumatin的基因工程上.三十年來,人們把thaumatin基因轉(zhuǎn)入不同的宿主,包括大腸桿菌、真菌和高等植物等,希望獲得大量重組的具有活性的thaumatin,但結(jié)果并不理想,重組蛋白不是沒甜味就是產(chǎn)量很低,尤其在高等植物中難度更大.該文通過基因工程技術,構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA1302-tha,測序證明其正確性.將pCAMBIA1302-tha轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,侵染玉米18紅的胚性愈傷

3、組織,通過組培技術得到玉米陽性植株.提取玉米18紅陽性植株基因組DNA,分別用PCR、PCR-Southem和Southem雜交檢測轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果顯示thaumatin cDNA基因已整合到轉(zhuǎn)基因玉米中.用轉(zhuǎn)基因玉米的總RNA通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄擴增出thaumatin cDNA基因,其Northern blotting檢測出現(xiàn)目的雜交條帶,證明在35S啟動子及其它調(diào)控元件的控制下,thaumatin cDNA基因在轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)錄

4、出mRNA,轉(zhuǎn)基因玉米可溶性總蛋白的SDS-PAGE檢測也發(fā)現(xiàn)相應分子量的蛋白條帶.最后甜味品嘗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米尚無甜味,證明thaumatin cDNA基因在轉(zhuǎn)基因玉米中還未表達成有活性的甜味蛋白.顯然,外源甜味蛋白基因thaumatin在玉米中未能表達成有活性的蛋白與很多原因有關,例如,Thaumatin蛋白來源于Thaumatococcus daniellii Benth果實的假種皮中,所以預期表達部位可能是玉米穗部,實驗還未及對穗