煙草CycB基因的過(guò)表達(dá)及在粉藍(lán)煙草遺傳瘤中的表達(dá)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)首先從“Havana SRI”煙草品種中克隆了CycB基因并構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體。然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行了煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)PCR、Southern分子雜交和Northern分子雜交對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鑒定。為了比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的地上部分的生長(zhǎng)量、葉片在組織培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)和分化及其兩種類型植株中DNA的含量。Northern雜交分析了CycB基因在野生煙草的不同組織(莖端、嫩葉、花芽和根)中的表達(dá)情況。
　

2、　 同時(shí)對(duì)煙草遺傳瘤中CycB基因的表達(dá)進(jìn)行了研究。首先從粉藍(lán)煙草(Nicotiana.glauca)中得到了遺傳瘤(NG),從粉藍(lán)煙草x郎氏煙草(N.langsdorffii)的雜交種中得到雜交瘤(H)。然后比較了遺傳瘤株系(NG1-NG4)和雜種瘤株系(H1-H3)形態(tài)學(xué)、組培條件下生長(zhǎng)率和對(duì)植物植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的敏感性幾方面的差異。最終通過(guò)Northern探討了它們中CycB基因的表達(dá)情況。
　　 上述研究得到的具體結(jié)果如

3、下:
　　 1、煙草中CycB基因的過(guò)量表達(dá)研究
　　 (1)成功構(gòu)建了CycB植物表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)基因,進(jìn)行PCR、Southern雜交和Nouthern雜交都證實(shí)了轉(zhuǎn)基因的真實(shí)性,并且證明轉(zhuǎn)基因植株中CycB基因的表達(dá)信號(hào)很強(qiáng),但在是對(duì)照中其表達(dá)水平低到幾乎檢測(cè)不到。
　　 (2)用Northern雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)煙草植株不同部位的CycB基因的表達(dá)情況。雜交的結(jié)果表明CycB基因的表達(dá)

4、呈現(xiàn)出組織特異性:在莖端和花芽高水平表達(dá),而在葉片和根部位幾乎不表達(dá)。
　　 (3)取生長(zhǎng)了六周的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株,測(cè)量其地上部分高度。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株在生長(zhǎng)速率上與野生型對(duì)照間并無(wú)明顯的區(qū)別。
　　 (4)利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞中DNA的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株有著與野生型對(duì)照相似的細(xì)胞含量分布。說(shuō)明CycB基因的組成型表達(dá)并沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞周期的明顯變化。
　　 (5)在含有外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(細(xì)胞

5、分裂素和生長(zhǎng)素)的培養(yǎng)基上,野生型和轉(zhuǎn)基因的葉片均能產(chǎn)生不定芽；但當(dāng)不含任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí),野生型和轉(zhuǎn)基因的葉片的生長(zhǎng)情況差異極大,20％的轉(zhuǎn)基因葉仍能生成不定芽,而野生型葉片則退化死亡。
　　 (6)轉(zhuǎn)基因煙草根毛發(fā)育與對(duì)照存在較大的差異。轉(zhuǎn)基因煙草的根毛與對(duì)照相比則更濃密而且更長(zhǎng)。
　　 2、粉藍(lán)煙草遺傳瘤的形成及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IAA和6-BA對(duì)其的影響
　　 (1)粉藍(lán)煙草幼苗在MS培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)月

6、,可在根部產(chǎn)生遺傳瘤。這表明粉藍(lán)煙草的腫瘤發(fā)生可能跟營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺失或一些抑制性的代謝物的積累造成的脅迫有關(guān)。
　　 (2)粉藍(lán)煙草遺傳瘤可在無(wú)任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上繼續(xù)分化,而正常粉藍(lán)煙草開片在無(wú)任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上容易褐化死亡。
　　 (3)四個(gè)遺傳瘤株系(NG1-NG4)與三個(gè)雜交瘤株系(H1-H3)產(chǎn)生的幼苗有相似的特征,都表現(xiàn)為部分有組織腫塊,這些組織上都帶有萌芽狀態(tài)的葉芽或莖產(chǎn)生。掃描電鏡觀察到雜

7、交瘤生成的幼苗葉片比遺傳瘤有更多的葉表皮毛。
　　 (4)三個(gè)不同的雜交瘤株系(H1-H3)以及四個(gè)不同遺傳瘤株系(NG1-NG4)在不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天和30天時(shí),所有幼苗的生長(zhǎng)相對(duì)同步,且都表現(xiàn)出了較高的生長(zhǎng)率,生物量測(cè)定結(jié)果顯示它們之間沒(méi)有顯著差異。
　　 (5)遺傳瘤幼苗與雜交瘤幼苗在含有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IAA(0.1 mg/L,1.0 mg/L)和BA(0.1 mg/L,1.0 mg/