重組人sTRAIL和IL-6在煙草中的表達(dá)研究.pdf

1、植物生物反應(yīng)器，又稱“分子農(nóng)場”，是當(dāng)今植物基因工程研究的熱點領(lǐng)域。應(yīng)用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白具有成本低、易于儲存和運輸、無對人有害的病原體污染等優(yōu)勢。
　　 傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)化技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于藥用蛋白的生產(chǎn)。外源蛋白通過核轉(zhuǎn)化可以在胞質(zhì)中積累，或與定位信號肽融合后在葉綠體中積累。隨著葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展和改進(jìn)，“分子農(nóng)場”更加引入注目，同時具有了更廣闊的應(yīng)用前景。葉綠體轉(zhuǎn)化較傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)化有很多優(yōu)勢，如很高的外源蛋白表達(dá)量、無

2、位置效應(yīng)和基因沉默現(xiàn)象、可用多順反子方式表達(dá)多個基因、高生物安全性等。
　　 本研究首次將兩種藥用蛋白TRAIL（腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體）和IL-6(白細(xì)胞介素-6)分別在煙草中表達(dá)。
　　 TRAIL蛋白是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TNF)家族的成員，TRAIL與其可溶性部分(sTRAIL)均可選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而對正常的細(xì)胞沒有顯著影響。因此它們都是很有潛力的抗癌藥物。目前TRAIL作為抗癌治療蛋白已經(jīng)進(jìn)入

3、臨床Ⅱ期的研究。
　　 本研究首先將sTRAIL的編碼序列轉(zhuǎn)化到核基因組和葉綠體基因組中。在核轉(zhuǎn)化中，通過構(gòu)建不含和含有來自豌豆Rubiseo小亞基的葉綠體定位信號序列的轉(zhuǎn)化載體，使sTRAIL能夠分別在胞質(zhì)和葉綠體中積累。通過PCR和Southern反應(yīng)，鑒定了兩個葉綠體轉(zhuǎn)化的煙草株系(T3和T8)。RT-PCR結(jié)果顯示，這兩個株系中的$TRAIL的mRNA正常轉(zhuǎn)錄。經(jīng)過Western雜交鑒定，在這兩個株系的生長初期，都檢測到

4、了sTRAIL蛋白的積累。但是隨著繼代培養(yǎng)的進(jìn)行，sTRAIL的積累水平在兩個株系間差異很大。通過ELISA試驗對這兩個株系的sTRAIL表達(dá)水平進(jìn)行定量，結(jié)果顯示sTRAIL在轉(zhuǎn)化株糸T3中約占可溶性總蛋白的0.9％。實驗中也獲得了一些核轉(zhuǎn)化的煙草株系，分別為葉綠體定位表達(dá)株系和胞質(zhì)表達(dá)株系。所有這些株系都可以正常轉(zhuǎn)錄sTRA兒的mRNA。雖然部分葉綠體定位表達(dá)sTRAIL蛋白的株系可以檢測到該蛋白的積累，但是其積累水平僅為葉綠體轉(zhuǎn)基

5、因株系的1/40。而沒有進(jìn)行定位表達(dá)的核轉(zhuǎn)化株系外源蛋白的積累量則更低。
　　 IL-6是一種多效的細(xì)胞因子，具有很多生理功能，如刺激細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞分化、恢復(fù)輻射致?lián)p的造血和免疫功能。IL-6在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、造血調(diào)控和一些疾病的發(fā)生過程中起了關(guān)鍵性的作用。由于傳統(tǒng)的直接提取法制備價格昂貴、產(chǎn)量較低，嚴(yán)重阻礙了IL-6的相關(guān)研究和應(yīng)用。本研究中將人IL-6蛋白在煙草的葉綠體中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了兩個葉綠體轉(zhuǎn)

6、化株系。然而盡管可以通過RT-PCR檢測到兩個株系中1L-6基因的轉(zhuǎn)錄，但在Western檢測中卻沒有發(fā)現(xiàn)其蛋白的積累。IL-6在大腸桿菌中的表達(dá)實驗也非常困難。IL-6在原核起源的葉綠體中的低表達(dá)水平可能是由于其部分密碼子在原核mRNA翻譯系統(tǒng)中是稀有密碼子。．在葉綠體轉(zhuǎn)化的煙草株系中，由于外源基因的插入，發(fā)生了葉綠體基因組上的非預(yù)期重組現(xiàn)象。葉綠體基因組的重組參與了葉綠體基因組DNA的復(fù)制、修復(fù)等途徑，在維持葉綠體基因組DNA的穩(wěn)定

7、過程中起著重要的作用。本研究中共發(fā)現(xiàn)了三種非預(yù)期的重組現(xiàn)象，并通過PCR、反向PCR及鳥槍法克隆技術(shù)，確定了可通過同向重復(fù)誘發(fā)重組的熱點序列，分別為395 bp的psbA基因3’UTR序列，23 bp的I6S rrn基因啟動子的下游序列，15bp，rbcL基因的5'UTR序列。經(jīng)驗證，395bp的psbA基因3'UTR同向重復(fù)引發(fā)的重組導(dǎo)致了編碼光系統(tǒng)II的核心蛋白D1蛋白的psbA基因由葉綠體基因組環(huán)化脫落，從而導(dǎo)致了黃化及斑葉兩種異