重組人RGD-sTRAIL的基因克隆、表達、純化及腫瘤靶向性研究.pdf

1、目的 構建、表達融合有RGD短肽序列的人腫瘤壞死因子凋亡配體(RGD-sTRAIL)表達載體,表達產(chǎn)物RGD-sTRAIL經(jīng)純化后檢測其體外抑瘤活性以及研究體內對腫瘤組織部位的靶向作用.方法用PCR方法擴增融合有RGD序列的hTRAIL的114-281位氨基酸的cDNA,擴增產(chǎn)物與質粒載體pGEM3Zf(-)連接,構建克隆載體pGEM-RGD-sTRAIL.在宿主菌DH5 α中擴增重組質粒,由藍白菌落篩選的方法挑取陽性克隆提取質粒并由限

2、制性內切酶酶譜分析、DNA序列分析兩種方法進行鑒定正確后進行酶切回收目的RGD-sTRAIL DNA片段,將目的基因插入pET-lla中構建成表達載體,再次轉化大腸桿菌BL21,挑取單菌落提取質粒進行PCR鑒定.鑒定后的陽性克隆用IPTG進行誘導表達,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和免疫學鑒定正確后,純化包涵體,進行蛋白的變性、復性,復性后蛋白再經(jīng)離子交換和分子篩進行純化,得到純品RGD-sTRAIL,薄層掃描儀掃描凝膠以檢測純度.純化產(chǎn)物

3、RGD-sTRAIL蛋白以不同濃度處理人肺癌細胞系A549,觀察細胞的形態(tài)變化并用結晶紫染色法檢測RGD-sTRAIL的體外抗腫瘤活性.將純化后的RGD-sTRAIL和TRAIL蛋白分別經(jīng)尾靜脈注射導入荷瘤小鼠體內,不同時段后處死動物后取腫瘤部位組織,通過免疫組織化學的方法觀察目的蛋白在腫瘤部位的分布.結論成功構建重組RGD-sTRAIL表達載體,并在大腸桿菌中獲得表達,成功獲得包涵體復性后的純化蛋白.復性純化后的重組蛋白RGD-sTR