重組人巨細(xì)胞病毒嵌合肽的表達(dá)純化及活性研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在人群中非常普遍,主要是呈隱性或亞臨床感染,近年來發(fā)現(xiàn)該病毒不只在新生兒、免疫抑制及免疫缺陷患者中導(dǎo)致廣泛的臨床癥狀和死亡,而且可能與人類三大疾病--心血管疾病,惡性腫瘤及糖尿病有關(guān),因而建立HCMV的快速檢測(cè)方法具有重要意義。多種HCMV病毒蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,選用抗原性強(qiáng)、特異性好的蛋白抗原代替全病毒以檢測(cè)HCMV感染,是提高HCMV感染診斷的敏感性和

2、特異性的有效途徑。國(guó)外的研究證實(shí),HCMV的gp52蛋白和pp150蛋白具有較強(qiáng)的抗原性,在HCMV感染者的血清中其相應(yīng)的抗體檢出率較高,本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建串連有編碼gp52 C末端和編碼pp150 C末端兩個(gè)基因片段的pPIC9K-rHCMVp表達(dá)質(zhì)粒,并在畢赤酵母獲得成功表達(dá)。但該質(zhì)粒缺少純化標(biāo)記,不利于分離純化,本研究將該質(zhì)粒中人巨細(xì)胞病毒嵌合肽(rHCMVp)基因片段導(dǎo)入帶純化標(biāo)志his6的pPICZαA中,重新構(gòu)建、篩選了表達(dá)

3、人巨細(xì)胞病毒嵌合肽(rHCMVp)的基因工程酵母。根據(jù)其基因序列,設(shè)計(jì)引物從pPIC9K-rHCMVp上擴(kuò)增得到目的基因片段,并導(dǎo)入畢赤酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPICZαA中。通過電擊將線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115細(xì)胞中,篩選獲得表達(dá)量較高的重組菌株,研究了該菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件,包括不同誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度、pH值對(duì)人巨細(xì)胞病毒嵌合肽表達(dá)的影響。2L發(fā)酵罐進(jìn)行了高密度發(fā)酵,經(jīng)1%的甲醇、pH6.0的條件下誘導(dǎo)48h,最終菌體密度O

4、D600達(dá)到180,每升發(fā)酵液中含目的蛋白78.7mg,比搖瓶提高了4.8倍的產(chǎn)量。rHCMVp嵌合肽蛋白可通過高密度發(fā)酵大量獲得。通過金屬螯合親和層析分離純化發(fā)酵液上清,獲得較高純度的rHCMVp嵌合肽蛋白,進(jìn)行了活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該蛋白能被抗全病毒血清檢測(cè),且具有免疫原性；與市售進(jìn)口的ELISA人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)試劑盒相比,兩種方法的一致性較好,我們選擇的gp52和pp150兩個(gè)片段的嵌合肽蛋白作為包被抗原可用于HCMV感染的檢測(cè)