15699.重組人巨細(xì)胞病毒外被蛋白基因的表達(dá)

1、碩士學(xué)位論文重組人巨細(xì)胞病毒外被蛋白基因的表達(dá)Expressionof量沁combinantHumanCytomegaloVirusGeneofTegumentProtein1。egUmentrroteln學(xué)21018039大連理工大學(xué)DalianUmversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要人巨細(xì)胞病毒(HumanCytomegalovims，HCMV)是一種以亞臨床性感染或潛伏性感染為主要感染方式的病毒。HC

2、MV能嚴(yán)重危害孕婦和胎兒以及免疫力低下的個(gè)體，并且在世界范圍內(nèi)其感染性普遍存在?？笻CMV藥物可針對(duì)相關(guān)性疾病起到階段性改善作用，但存在毒副作用和耐藥性等缺陷，使得抗HCMV疫苗的研發(fā)更具有意義。評(píng)價(jià)抗HCMV疫苗的理想程度是根據(jù)其所包含的具有免疫作用的抗原成分。理想的抗原成分可誘導(dǎo)廣譜的中和抗體反應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)初次感染的預(yù)防有顯著作用，且對(duì)HCMV感染率與發(fā)病率有很好的控制效果，并解決了安全性與耐受性的問題。HCMV是

3、一種胞內(nèi)感染病毒，只有通過細(xì)胞免疫才能將其完全清除。常規(guī)的預(yù)防性疫苗主要是針對(duì)未感染的個(gè)體，誘導(dǎo)其有效的免疫應(yīng)答，對(duì)已感染的個(gè)體不起作用。因此，研發(fā)可清除病原體與感染細(xì)胞的治療性疫苗具有更深遠(yuǎn)的意義。外被磷蛋白65(Phosphoprotein65，pp65)和包膜糖蛋白B(Glyc叩roteinB，gB)在介導(dǎo)HCMV感染和病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要的作用，pp65是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫的主要抗原，而gB是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫的主要抗原。

4、本研究將pp65與gB抗原表位基因通過重疊延伸PCR融合，獲得融合基因pp65362—504一gB60762l，構(gòu)建重組表達(dá)載體pFLAGATS—pp65362—504一gB60762l并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，通過誘導(dǎo)條件的改變未獲得可溶性融合蛋白。為了實(shí)現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達(dá)，利用BactoBac系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。本研究構(gòu)建了一個(gè)同時(shí)編碼報(bào)告基因增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因和帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽片段的融合基因

5、的載體pFaLstBaclMDua卜EGFP—pp65362—504一gB60762l，兩個(gè)基因片段分別控制于p10和PH啟動(dòng)子，雙酶切反應(yīng)和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EcD玎DHl0Bac發(fā)生定點(diǎn)轉(zhuǎn)座產(chǎn)生重組桿粒bacmid—EGFP—pp65362。504一班607_62l，PCR驗(yàn)證其構(gòu)建正確。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組桿粒轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞系Sf9中，擴(kuò)增獲得的桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。通過SDS—PAGE和