人巨細胞病毒對臍血紅系祖細胞HOXB6基因表達的影響.pdf

1、目的：應用實時熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應(fluorogenicquantitivereversetranscriptionpolymerizechainreaction,FQ-RT-PCR)方法，檢測經(jīng)人巨細胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)感染和/或全反式維甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)和/或三氧化二砷(arsenictrioxide，ATO，AS2O3)處理的人臍血造血紅系祖

2、細胞(ColonyFormingUnit-Erythroid，CFU-E；BrustFormingUnit-Erythroid，BFU-E)的HOXB6(homeoboxB6gene)基因的mRNA定量表達情況，在基因水平探討HCMV感染導致造血紅系祖細胞損害的機制。 方法：1.3例臍血標本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。采用造血祖細胞體外培養(yǎng)技術，以HCMV持續(xù)感染和/或ATRA和/或AS2O3處理人

3、臍血紅系祖細胞，觀察HCMV感染后和/或ATRA和/或AS2O3處理后的CFU-E，BFU-E集落形態(tài)及峰期。2.實驗分組：實驗分成6組①空白對照組：在正常培養(yǎng)體系中，不加任何的處理因素。②HCMV組：按100TCID50HCMV-AD169病毒液0.1ml感染正常的培養(yǎng)體系。③ATRA組：在正常培養(yǎng)體系中加入維甲酸，終濃度為10-6mol/l。④HCMV+ATRA組：在上述同樣的人巨細胞病毒組中加入維甲酸，終濃度同上。⑤AS2O3組：

4、在正常培養(yǎng)體系中加入三氧化二砷，終濃度為10-6mol/l。⑥HCMV+AS2O3組：在上述同樣的人巨細胞病毒組中加入三氧化二砷，終濃度同上。3.采用原位聯(lián)苯胺染色法鑒定紅系祖細胞。4.不同時間點即第3天，第7天，第10天分別提取各組細胞RNA，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。5.利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術和隨機引物將總RNA逆轉錄成cDNA，設計基因特異引物在實時熒光定量PCR儀進行體外擴增。將H

5、OXB6基因cDNA和人磷酸甘油醛脫氫酶(gluceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)基因陽性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標準曲線，根據(jù)各個樣本循環(huán)指數(shù)增長期的起始點即循環(huán)域值(cyclethreshold,Ct)和標準曲線斜率值計算各樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值，以GAPDH基因作為內(nèi)參照進行標化，統(tǒng)計并分析各組樣本的HOXB6基因表達的mRNA是否存在差異。統(tǒng)計方法：結果用均數(shù)加減標準差(

6、-x±S)，進行單因素方差分析，有統(tǒng)計學意義后組間均數(shù)用兩兩比較方法，由統(tǒng)計軟件SPSS11.5完成。 結果：1.集落細胞的形態(tài)學鑒定，原位聯(lián)苯胺染色法證明所培養(yǎng)的是造血紅系祖細胞。2.1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結構完整，無明顯降解。3.逆轉錄PCR擴增三組均有目的基因HOXB6和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)生，與DNA分子Marker相比示擴

7、增產(chǎn)物大小分別為119bp和141bp。4.HOXB6基因mRNA在6個組即正常的紅系祖細胞，HCMV感染后的紅系祖細胞，以及ATRA和AS2O3處理過的紅系祖細胞和先感染HCMV后用ATRA/AS2O3處理的紅系祖細胞中定量表達情況，經(jīng)過單因素方差分析和SPSS11.5forwindows統(tǒng)計分析結果顯示，在正常培養(yǎng)體系中紅系祖細胞隨第3天，第7天，第10天時間推移持續(xù)表達HOXB6基因，且表達持續(xù)上調(diào)；在HCMV感染后，紅系祖細胞H

8、OXB6基因的表達隨著第3天，7天，10天時間的推移與空白對照組比較，明顯持續(xù)下調(diào)，即表達被抑制；ATRA組與空白對照組比較，能持續(xù)顯著上調(diào)紅系祖細胞的HOXB6基因的表達，且隨著第3天，第7天，第10天時間延長，表達量逐漸升高；ATRA也能上調(diào)對HCMV感染后的第3天和第7天紅系祖細胞的HOXB6基因的表達，但是ATRA對HCMV感染后的第10天紅系祖細胞HOXB6基因的表達與空白對照組相比統(tǒng)計學上無顯著差異；AS2O3與空白對照組比

9、較，能隨著時間推移逐漸下調(diào)紅系祖細胞和HCMV感染后的紅系祖細胞的HOXB6基因的表達，結果有統(tǒng)計學意義；與HCMV組比較，結果無統(tǒng)計學意義。 結論：1.HOXB6基因在臍血紅系造血祖細胞中持續(xù)穩(wěn)定的表達，且與紅系造血有密切的相關性。2.HCMV感染能誘導臍血紅系造血祖細胞HOXB6基因表達下調(diào)，HCMV有可能通過調(diào)控HOXB6基因表達異常而引起造血系統(tǒng)損害。3.ATRA和AS2O3可以調(diào)控HOXB6基因的表達。4.本實驗采用T