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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:本課題主要探討人類臍血造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)向粒系(Colony Forming Unit-Granulocyte,CFU-G)發(fā)育過(guò)程中Hoxa9、Hoxa10基因表達(dá)的情況,用人類巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)和/或全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)進(jìn)行干預(yù),在基因水平探討HCMV感染導(dǎo)致臍血粒系祖細(xì)胞損傷的
2、機(jī)制。 方法:1.12例臍血標(biāo)本由本院產(chǎn)房提供,取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。2.實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分4組:(1)空白對(duì)照組(Normal):不加病毒液,代之等量DMEM/F12培養(yǎng)基加入基本培養(yǎng)體系。(2)ATRA組:加入ATRA稀釋液,終濃度6×10-8mol/l。(3)HCMV組:HCMV-AD169滴度為106蝕斑形成單位(plaque formation unit,PFU)/ml,按0.1ml 105 PFU/
3、ml接種培養(yǎng)體系。(4)ATRA+HCMV組:同時(shí)加入ATRA及HCMV-AD169病毒稀釋液0.1ml,終濃度同上。3.采用造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù),以HCMV-AD169和(或)ATRA持續(xù)干擾人類造血干細(xì)胞,觀正常組、ATRA組、HCMV組、ATRA+HCMV組的造血干祖細(xì)胞經(jīng)人粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating,G-CSF)誘導(dǎo)后,在培養(yǎng)過(guò)程第3天,7天和12天的粒系祖細(xì)胞集落(Col
4、onyFormingUnit-Granulocyte,CFU-G)生成情況。4.采用瑞氏染色法鑒定粒系祖細(xì)胞集落成分。5.第3天、第7天、第12天分別提取各組細(xì)胞總RNA,用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。6.通過(guò)隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain reacti
5、on,FQ-RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)臍血粒系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中各組Hoxa9、Hoxa10基因的表達(dá)。7.隨機(jī)抽取逆轉(zhuǎn)錄的Hoxa9、Hoxa10基因進(jìn)行電泳分別獲得Hoxa9、Hoxa10基因在3天、7天、12天電泳圖。將Hoxa9、Hoxa10基因cDNA和人磷酸甘油醛脫氫酶(Gluceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因陽(yáng)性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各個(gè)樣本循環(huán)指數(shù)
6、增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即循環(huán)域值(cycle threshold,Ct)和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算各自樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值,以GAPDH基因作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化。8.統(tǒng)計(jì)方法:結(jié)果用DNA相對(duì)拷貝數(shù)和RNA表達(dá)相對(duì)量(2-△△α)表示Hoxa9、Hoxa10基因相對(duì)表達(dá)量,采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示Hoxa9、Hoxa10基因的變化情況。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),TOW-WAY AONVA方差分析,組間均數(shù)兩兩比較用LSD法,正常組Hoxa9及H
7、oxa10基因相對(duì)表達(dá)量比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)均數(shù)t檢驗(yàn)。由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS10.0完成。 結(jié)果:1.集落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定,瑞氏染色法證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是粒細(xì)胞。2.1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊,無(wú)明顯拖尾及彌散,說(shuō)明RNA結(jié)構(gòu)完整,無(wú)明顯降解。3.逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增三組均有目的基因Hoxa9、Hoxa10和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)物,與DNA分子Marker相比示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分
8、別為:Hoxa9為144bp,Hoxa10為166個(gè)堿基(bp),GAPDH基因?yàn)?41bp,與預(yù)定理論值大小符合。4.在第3天、7天、12天Hoxa9基因相對(duì)表達(dá)量較Hoxa10高。從電泳圖也可以直觀看出,各時(shí)間點(diǎn)Hoxa9基因各電泳條帶均較Hoxa10電泳條帶亮度亮,寬度寬,表明Hoxa9基因表達(dá)產(chǎn)物較H0xa10高。5.隨時(shí)間推移,正常對(duì)照組、 ATRA組、HCMV組、及ATRA+HCMV組,Hoxa9、Hoxa10基因均在增殖分
9、化的第7天表達(dá)最強(qiáng)烈,第12天表達(dá)明顯減弱。6.與正常對(duì)照組比較,Hoxa9、Hoxa10基因受ATRA(6×10-8mol/L)上調(diào),而受HCMV下調(diào)。7.與HCMV組比較,ATRA有抑制HCMV所致的Hoxa9、Hoxa10基因的下調(diào)作用。 結(jié)論:1.Hoxa9、Hoxa10基因在臍血粒系祖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)規(guī)律的表達(dá),提示Hoxa9、Hoxa10基因均與粒系造血有相關(guān)性。2.人類造血干細(xì)胞向粒系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中,正常對(duì)
10、照組、ATRA組、HCMV組及ATRA+HCMV組的Hoxa9、Hoxa10基因第3天少量表達(dá),第7天表達(dá)最強(qiáng)烈,第12天表達(dá)明顯下降。3.Hoxa9基因可能是人類造血干祖細(xì)胞向粒系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程的主要基因之一。4.HCMV能使Hoxa9、Hoxa10基因表達(dá)下調(diào),提示HCMV可能通過(guò)調(diào)控Hoxa9、Hoxa10基因表達(dá)異常引起造血系統(tǒng)的損害。5.ATRA(6×10-8mol/L)能上調(diào)Hoxa9、Hoxa10基因的表達(dá),提示ATR
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