HOXA9基因在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）在世界范圍中屬于嚴(yán)重的致死性腫瘤之一，尤其是在東亞和非洲撒哈拉以南地區(qū)。在中國，肝癌是男性中發(fā)病率居第三位、女性中居于第六位的惡性腫瘤，2015年我國新診斷肝癌病例466100例。同時(shí)，由于大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，總體生存期差，現(xiàn)在肝癌已經(jīng)成為我國死亡率居于第三位的惡性腫瘤。因此，我國面臨的肝癌的負(fù)擔(dān)很重。病毒感染，包括乙肝病毒和丙肝病毒等、長期接

2、觸黃曲霉毒素、以及遺傳疾病如a-1抗胰蛋白酶缺乏癥和Wilson疾病，是肝癌的相關(guān)危險(xiǎn)因素。HCC的發(fā)病機(jī)制具有異質(zhì)性和復(fù)雜性，近年來，隨著測序技術(shù)和人類基因組計(jì)劃的完成，HCC相關(guān)的一些遺傳性標(biāo)志物和通路已經(jīng)被報(bào)道，但是其特異性和敏感性都不高。因此，為了提高患者的早期診斷水平和改善預(yù)后，更多的分子標(biāo)志物需要被發(fā)現(xiàn)。
　　同源盒（Homeobox,HOX）基因首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)也存在于包含人在內(nèi)的脊椎動(dòng)物中。HOX基因的

3、蛋白編碼產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子家族，具有控制胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的作用。哺乳動(dòng)物中，HOX基因家族包括39個(gè)成員，其異常表達(dá)與身體發(fā)育不良和多種腫瘤密切相關(guān)。同源盒A9(Homeobox A9,HOXA9)基因是HOX基因家族之一，在造血過程中具有重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，HOXA9基因在約一半的急性髓性白血病患者表達(dá)升高，并與其不良預(yù)后相關(guān)。此外，HOXA9基因在乳腺癌、卵巢癌、惡性膠質(zhì)瘤，非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中均表達(dá)異常，在不同腫瘤中發(fā)揮癌基

4、因或抑癌基因的功能。但是，HOXA9基因在肝癌中的作用尚未有報(bào)道。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制。調(diào)節(jié)EMT過程的機(jī)制非常復(fù)雜，其中TGF-β信號(hào)通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程中，smad通過直接激活EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，可促進(jìn)相關(guān)基因的重組并控制下游靶基因的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子包括Snail1,Snail

5、2,ZEB1,ZEB2,Twist等。我們課題組前期通過全基因組外顯子測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)HOXA9基因在HCC中存在功能缺失突變，在此基礎(chǔ)上我們的研究發(fā)現(xiàn)HOXA9在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)量相對(duì)降低，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí) HOXA9抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。通過研究HOXA9基因與EMT的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以下調(diào)HOXA9基因的表達(dá)，HOXA9抑制EMT過程，與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　目的：
　　1.檢測HO

6、XA9在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，并分析與患者臨床病理特征的關(guān)系；
　　2.分析HOXA9基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響；
　　3.初步探索HOXA9基因發(fā)揮作用的可能分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用免疫組織化學(xué)方法（Immunohistochemistry,IHC）檢測肝細(xì)胞肝癌石蠟樣本中HOXA9的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系；
　　2.利用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（

7、real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（western-blot,WB）檢測HOXA9基因在不同肝細(xì)胞系（HL-7702,HepG2,SK-hep-1,SMMC-7721,MHCC-97H）中的表達(dá)。
　　3.分別構(gòu)建HOXA9基因真核表達(dá)質(zhì)粒和siRNA，利用轉(zhuǎn)染試劑和脂質(zhì)體2000將相關(guān)的質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞HepG2和MHC

8、C-97H中，qRT-PCR和WB檢測基因過表達(dá)及干擾效率；MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測 HOXA9對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的作用，并利用流式技術(shù)分析其對(duì)細(xì)胞周期的影響；
　　4.不同濃度的TGF-β1刺激細(xì)胞，qRT-PCR檢測其對(duì)HOXA9及 EMT相關(guān)分子（E-cadherin、N-cadherin）的作用；并通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測 TGF-β1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能

9、力的影響；
　　5.過表達(dá)HOXA9基因后，觀察其對(duì)E-cadherin,N-cadherin等分子的作用，并利用細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)比較單純TGF-β1刺激組、TGF-β1刺激后過表達(dá)HOXA9基因組、及對(duì)照組間細(xì)胞遷移、侵襲能力的差異。
　　結(jié)果：
　　1.HOXA9在81例肝癌組織中表達(dá)陽性率明顯低于癌旁組織，且與肝癌分級(jí)相關(guān)；
　　2.與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，HOXA9在肝癌細(xì)胞系中mRNA和蛋白表達(dá)水平

10、較低；
　　3.qRT-PCR及WB結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染HOXA9表達(dá)質(zhì)粒促進(jìn)其基因表達(dá)；轉(zhuǎn)染siRNA抑制其基因表達(dá)；MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HOXA9可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HOXA9基因可以顯著抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力；
　　4.不同濃度TGF-β1刺激肝癌細(xì)胞，HOXA9表達(dá)量下調(diào)，以5ng/ml最明顯；TGF-β1可以抑制E-cadherin、促進(jìn)N-cadherin的表達(dá)

11、，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；
　　5.HOXA9促進(jìn)E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平，而抑制N-cadherein表達(dá)；劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，TGF-β1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2和MHCC-97H的遷移及侵襲能力，但轉(zhuǎn)染HOXA9基因后，其促進(jìn)作用被明顯抑制。
　　結(jié)論：
　　1.HOXA9基因在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平降低，且與肝癌分級(jí)相關(guān)；
　　2.HOXA9可以抑