MiR-376a在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、MicroRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)高度保守的，存在于動(dòng)植物以及病毒中的長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，miRNA主要通過(guò)與靶標(biāo)基因3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的完全或不完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，從而廣泛參與調(diào)控個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA的表達(dá)紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。肝癌是發(fā)病率和致死率都很高的惡性腫瘤之一，5年生存率不到40％，嚴(yán)重危害人們的生命和健康。因此，

2、揭示肝癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究對(duì)于有效地預(yù)防肝癌，提高肝癌的治療效果有重要意義。近幾年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了許多在HCC中起重要作用的microRNA并闡述了其作用機(jī)制，比如miR-221，miR-222，miR-21，miR-122等以及許多與腫瘤分化，腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后等臨床指征相關(guān)microRNA，豐富了肝癌發(fā)病機(jī)制的理論認(rèn)識(shí)。
　　 人和動(dòng)物的肝臟都具有極強(qiáng)的調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)和大小的能力，肝切除后肝臟即進(jìn)入增殖狀態(tài)，引起一系列肝再生因子水

3、平的變化，比如：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGFHepatocyteGrowthFactor)，這些因子一方面使肝再生精確、有序地進(jìn)行，另一方面也有可能影響腫瘤細(xì)胞所處的環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，肝再生和肝癌之間有著非常密切的聯(lián)系。本研究組用microRNA芯片篩選小鼠肝再生早期發(fā)生變化的microRNA時(shí)，篩選到Mmu-miR-376b在肝再生早期表達(dá)是下調(diào)的，又因?yàn)楦卧偕缙谂c肝癌發(fā)生過(guò)程中有許多共有的調(diào)節(jié)因子，因此我們?cè)囅雖iR-376在

4、肝癌中的表達(dá)是否發(fā)生異常，而miR-376的異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展又有怎樣的關(guān)系。Hsa-miR-376b與Hsa-miR-376a之間有很強(qiáng)的同源性，因此我檢測(cè)了miR-376a和miR-376b在肝癌組織中的表達(dá)變化，并發(fā)現(xiàn)miR-376a在肝癌組織中的變化較miR-376b明顯，因此我們以miR-376a為研究對(duì)象，研究其在肝癌中的作用機(jī)制。
　　 目前已經(jīng)有幾篇文章報(bào)道了miR-376在人肝內(nèi)膽管癌，上皮卵巢癌等腫瘤中

5、表達(dá)是下調(diào)的，而對(duì)于miR-376功能的研究尚知之甚少，并且miR-376在肝細(xì)胞癌中的作用及其機(jī)制研究未見(jiàn)諸報(bào)道。本論文針對(duì)miR-376a研究其在肝癌組織中的表達(dá)規(guī)律并進(jìn)一步探討其功能及分子機(jī)制，為更好地闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并探索肝癌潛在的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、miR-376a在肝癌組織中的表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究
　　 我們?cè)诟伟?biāo)本中檢測(cè)了miR-376b和miR-376a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR

6、-376a的表達(dá)變化趨勢(shì)更明顯，在大多數(shù)癌組織中的表達(dá)低于其癌旁組織，說(shuō)明miR-376a表達(dá)水平的降低是肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)高頻事件。因此，本文以miR-376a為研究對(duì)象研究其生物學(xué)功能以及臨床意義。通過(guò)對(duì)miR-376a在肝癌組織及癌旁組織中的的表達(dá)變化與臨床指征進(jìn)行關(guān)聯(lián)，卡方檢驗(yàn)結(jié)果提示，miR-376a的表達(dá)變化與血清甲胎蛋白的水平有關(guān)，即血清中甲胎蛋白高的患者其癌組織中的miR-376a的表達(dá)水平也較高，由于甲胎蛋白是肝

7、癌診斷的標(biāo)志物，提示miR-376a可能輔助甲胎蛋白作為肝癌診斷潛在的標(biāo)志物。
　　 為了明確miR-376a在肝癌發(fā)生中的生物學(xué)功能，我們用miR-376amimics處理肝癌細(xì)胞系(Huh7和HepG2)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞的增殖能力，通過(guò)AV-FITC/PI染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞凋亡率，并將miR-376基因克隆進(jìn)pcDNA3.1質(zhì)粒中，并篩選了穩(wěn)定表達(dá)maR-376的Huh7細(xì)胞株，并以該細(xì)胞株荷瘤裸鼠，檢測(cè)裸

8、鼠的成瘤率。結(jié)果顯示，miR-376a抑制了細(xì)胞增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，并且抑制了Huh7細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤率。
　　 二、miR-376a下游調(diào)控機(jī)制的研究
　　 為了探討miR-376a的抑癌機(jī)制，我們通過(guò)Targetscan軟件預(yù)測(cè)了miR-376a的候選靶基因，得到了大約220個(gè)候選靶基因。為了從中篩選到起關(guān)鍵作用的靶基因，我們進(jìn)一步用博奧公司的MAS軟件對(duì)候選靶基因進(jìn)行了信號(hào)通路分析以及GO功能分析，Pathw

9、ay分析結(jié)果顯示，候選靶基因相互作用構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，而PIK3R1處于這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)位置，即Hub基因。文獻(xiàn)提示，Hub基因?qū)τ诰S持網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定起著關(guān)鍵的作用，并且越來(lái)越多的研究表明，microRNA傾向于調(diào)控Hub基因。而qRT-PCR和WesternBlotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-376a降低了PIK3R1的表達(dá)水平。并且，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，PIK3R1是受miR-376a直接調(diào)控的靶基因。另外，我們通過(guò)W

10、B的方法檢測(cè)了肝癌組織中p85α(PIK3R1)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p85α在肝癌組織中是表達(dá)上調(diào)的，與miR-376a的表達(dá)趨勢(shì)是相反的，并且我們做了統(tǒng)計(jì)分析，兩者存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，說(shuō)明肝癌組織中p85α的表達(dá)上調(diào)與miR-376a的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
　　 為了探討PIK3R1的生物學(xué)功能，我們通過(guò)RNAi和過(guò)表達(dá)的方法處理Huh7細(xì)胞，然后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和AV-FITC/PI染色的方法分別檢測(cè)了細(xì)胞增殖的變化和細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示H

11、uh7細(xì)胞中的PIK3R1被有效干擾后，細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高，而PIK3R1過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率降低。說(shuō)明PIK3R1是抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。這與文獻(xiàn)報(bào)道的是一致的。另有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-29可以通過(guò)靶向抑制PIK3R1而激活p53的表達(dá)，那么我們猜想miR-376a既然可以靶向抑制PIK3R1的表達(dá)，那么p53的表達(dá)水平是否變化了呢，我們發(fā)現(xiàn)miR-376amimics處理Huh7細(xì)胞后p53表達(dá)升高了，并且Hu

12、h7細(xì)胞中PIK3R1被干擾后，p53表達(dá)也升高了。因此，我們推測(cè)，miR-376a可通過(guò)抑制PIK3R1的表達(dá)而激活p53的表達(dá)。
　　 三、miR-376a上游表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究
　　 有文獻(xiàn)提示，在人上皮卵巢癌細(xì)胞系(EOC)中miR-376a所在基因簇的表達(dá)水平受表觀遺傳修飾的調(diào)節(jié)。為了探討肝細(xì)胞中miR-376a基因簇是否受表觀遺傳修飾的控制，我們用DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR和組蛋白去乙酰化酶抑制劑

13、PBA處理大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A和Huh7細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，這兩個(gè)細(xì)胞株中的miR-376a表達(dá)都升高了，說(shuō)明是表觀遺傳修飾的變化激活了miR-376a的表達(dá)。另有報(bào)道稱(chēng)microRNA與表觀遺傳修飾相互影響共同參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，那么在miR-376a的候選靶基因中是否有與表觀遺傳相關(guān)的基因呢，通過(guò)MAS軟件對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)了HDAC9這個(gè)靶基因，隨即我們通過(guò)RT-PCR和WB驗(yàn)證，證實(shí)了HDAC9是受miR

14、-376a調(diào)控的靶基因。已知HDAC9抑制MEF2介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，且有文獻(xiàn)證實(shí)MEF2是調(diào)控miR-376a所在基因簇的轉(zhuǎn)錄因子。因此我們分別將HDAC9和MEF2干擾掉，再檢測(cè)miR-376a的表達(dá)，結(jié)果顯示HDAC9被干擾后miR-376a的表達(dá)上調(diào)了，說(shuō)明HDAC9是抑制miR-376a表達(dá)的；而MEF2被干擾后，miR-376a表達(dá)下調(diào)了，說(shuō)明MEF2正向調(diào)控miR-376a的表達(dá)。以上結(jié)果表明，miR-376a的表達(dá)受表觀遺傳