新分子Mir-216b在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展中作用機理的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 研究在肝細胞癌家族史患者與健康無肝細胞癌家族史志愿者血漿間microRNA表達譜的不同
　　實驗目的：探討肝細胞癌家族史患者與健康無肝細胞癌家族史志愿者血漿間microRNA表達譜的不同。
　　實驗方法：
　　1、從華中科技大學附屬同濟醫(yī)院肝臟外科的既往就診患者中，挑選患有肝細胞癌的患者，進行嚴格的篩查，從中選出直系親屬（如父母、兄弟姐妹和子女）也患有肝細胞癌的患者

2、，利用復查或住院手術期間，告知其實驗目的后，簽署知情同意書后，采集他們的外周靜脈血。血液樣品采集后置入含有EDTA成分的抗凝試管中，隔絕空氣于4℃低溫貯存，在采集樣本后1小時內，經(jīng)過離心法提取上清血漿成分，馬上貯存于-80℃的低溫冰箱中。
　　2、患者血漿樣品與同時提取的無肝細胞癌家族史健康志愿者的血漿樣品，存放于含有液氮的低溫罐中，經(jīng)飛機運送到上海博豪生物有限公司。使用最新的基于16.0數(shù)據(jù)庫的microRNA芯片進行兩組間篩查

3、對比。由microRNA芯片所獲得的的結果，經(jīng)過與健康志愿者對比分析，選出在肝癌家族史患者血漿中變化一致的miRNAs，而且表達量變化超過20倍的幾種miRNA。
　　3、查閱大量文獻，選擇目前尚未在肝癌中報道過的miRNA進行進一步的研究。
　　實驗結果：
　　1、共收集到肝細胞癌家族史患者3例，患者中都至少有一個直系親屬同時患有肝細胞癌，各提取外周靜脈血5ml。經(jīng)過高速離心后，提取上清黃色透明液體，每例標本均提取淡

4、黃色血漿3ml左右，貯存于高溫處理和去 RNA酶處理的1.5mlEP管中，保存于-80℃。
　　2、經(jīng)過嚴格的三次實驗比對，共檢出46種差異表達的microRNA，其中三例標本表達變化趨勢一致的共有27個。
　　3、表達量變化超過20倍的共有14個，其中在肝細胞癌家族史患者血漿中表達升高的有12中，降低的有2中，而這14種miRNA均未在肝癌中報道過。
　　第二部分 在兩組間血漿中表達差異明顯的microRNA在其他肝

5、癌患者血漿中的驗證
　　實驗目的：通過RT-PCR法驗證芯片結果，并且擴大樣本，引入非肝細胞癌家族史病人的血液標本，從而驗證芯片所獲結果的實用和有效性。
　　實驗方法：
　　1、選擇在2012年11月到2013年4月因肝細胞需要行手術治療的患者10例，術前告知患者實驗目的，簽署知情同意書后，采集外周靜脈血樣品5ml。同樣的方式采集10例無乙型肝炎的肝血管瘤患者的外周靜脈血5ml。血液樣品采集后置入含有EDTA成分的抗凝

6、試管中，隔絕空氣于4℃低溫貯存，在采集樣本后1小時內，經(jīng)過離心法提取上清血漿成分，馬上貯存于-80℃的低溫冰箱中。
　　2、使用ABI Ambion公司的mirVana PARIS試劑盒，進過多步離心純化，提出血漿樣品中的全部miRNA后，以無RNA酶水溶解后置入經(jīng)過高溫高壓及無RNA處理過的1.5mlEP管中，貯存于-80℃條件下。提取后的miRNA樣品，使用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Maste

7、r Mix試劑盒，加入Invitrogen公司定制的miRNA頸環(huán)引物，進行逆轉錄，獲得所有miRNA的cDNA樣品，貯存于-20℃冰箱中。
　　3、上一步驟獲得的cDNA樣品，使用Invitrogen公司定制的miRNA上下游引物，同時使用Takara公司的One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒，于ABI Step-one RT-PCR機中，進行擴增，實時定量檢測目的miRNA的表達。使用

8、2-ΔΔct法對數(shù)據(jù)進行標準化，再利用T檢驗比較兩組間表達量的的差異，最后得出的結果與芯片結果進行比對，以驗證芯片結果的可靠性。
　　實驗結果：
　　1、經(jīng)過嚴格的篩選，術后肝癌組織經(jīng)過病理檢查，確診為原發(fā)性肝細胞的患者的血液樣本采集完畢，患者對實驗均知情同意，簽字同意。10例原發(fā)性肝細胞癌患者血液樣本標號為1-10，同時，在此期間住院手術的肝血管瘤患者，確定無肝癌家族史及乙肝病史的10例患者也篩選完畢，同時采集血液樣品。經(jīng)

9、過多步離心，使用高溫高壓滅菌和無RNA酶化處理過的試管、槍頭處理樣品，每個樣品均獲得3ml左右淡黃色半透明血漿樣品，提取過程均在低溫下進行。
　　2、取適量血漿樣品，經(jīng)過多步離心、洗滌、純化和溶解后，每400μL血漿樣品獲得濃度約1μg/μL的Total RNA樣品30μl。貯存于高溫高壓滅菌和無RNA酶化處理過的EP管內，-80℃保存。獲得的RNA樣品，吸取1-2μL左右，使用Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR

10、 RT Master Mix反應體系，加入針對各類miRNA的頸環(huán)引物，使用PCR儀，進行逆轉錄反應，獲得每個樣本的cDNA樣品10μL。由于miRNA的特殊性，第一部分實驗篩查出的14種miRNA，必須分別加入特定的頸環(huán)引物，所以這20個患者共獲得cDNA樣品280個。貯存于-20℃下。
　　3、上一步獲得的cDNA樣品，使用Invitrogen公司定制的miRNA上下游引物，同時使用Toyobo公司的SYBR Green Re

11、altime PCR Master Mix-Plus試劑盒，于ABI Step-one RT-PCR機中進行RT-PCR反應，所得數(shù)據(jù)記錄在電腦中，經(jīng)過內參標準化。每個樣本的每一種miRNA樣品的RT-PCR實驗都重復三遍，每次都有兩個附孔。使用2-ΔΔct法對數(shù)據(jù)進行標準化后，再與所獲得的芯片結果進行比對，發(fā)現(xiàn)芯片結果得到驗證，這10例原發(fā)性肝細胞癌患者組與10例肝血管瘤患者組的14種miRNA的表達量的變化都與芯片結果一直，但是表達

12、量的差異程度略小于芯片結果。經(jīng)過更大樣本的驗證，芯片所獲得結果真實可靠，可以進行下一步實驗。
　　第三部分 miR-216b在原發(fā)性肝細胞癌患者的癌組織中的表達量與癌旁肝組織中的表達量的變化，并與血漿芯片結果進行比對，同時研究miR-216b的表達與患者臨床病理參數(shù)和預后的相關性。
　　實驗目的：繼續(xù)使用RT-PCR法對原發(fā)性肝細胞患者手術標本中的miRNA表達量進行檢測，選出代表性的miRNA進行進一步研究。
　　實

13、驗方法：
　　1、對前幾部分實驗所獲得的數(shù)據(jù)進行比對，從中選擇出表達差異最為明顯的miRNA進行組織中表達量的進一步驗證。
　　2、隨機選取從2008.4-2013.4在本院住院手術的原發(fā)性肝細胞癌患者50例，術中標本按癌組織和癌旁肝組織進行取材，低溫貯存于液氮中運輸，分裝后-80℃貯存。這50對標本，進行勻漿、離心等多部實驗，提取出樣品total RNA。
　　3、查閱大量文獻后，選取miRNA-216b進行下一步研

14、究，上述步驟所取得的RNA樣品，使用 Toyobo公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒，加入Invitrogen公司定制的miRNA-216b頸環(huán)引物，進行逆轉錄，獲得的cDNA樣品，貯存于-20℃冰箱中。獲得的cDNA樣品，使用Invitrogen公司定制的miRNA-216b上下游引物，同時使用Toyobo公司的SYBR?Green Realtime PCR Master Mix-Plus試劑盒

15、，于ABI Step-one RT-PCR機中，進行擴增，實時定量檢測miRNA-216b的表達。
　　4、上述結果，使用2-ΔΔct法對數(shù)據(jù)進行標準化，再利用 T檢驗比較癌組織與癌旁組織的表達量的差異。
　　5、結合患者臨床病理資料，比較不同病理分期、腫瘤大小、遠處轉移等臨床病理因素對于miRNA-216b的表達的影響。
　　6、對于上述患者進行隨訪，調查術后患者生存情況、復發(fā)情況，從而研究miRNA-216b的表達

16、與患者術后預后的影響。
　　實驗結果：
　　1、經(jīng)過查閱大量文獻，發(fā)現(xiàn)miR-216b從未在肝癌中被報導過。芯片結果也顯示，它在肝細胞癌家族史患者血漿中的表達與無家族史健康志愿者血漿中的表達差異最為明顯，降低約122倍。說明這可能是一個抑癌基因，所以挑選它作為繼續(xù)研究的靶點。
　　2、選取30-60之間的患者，于術中采集新鮮的肝癌及癌旁組織標本，貯存于-80℃。以trizol提取組織Total RNA樣品，每個樣品各獲

17、得RNA30μL，濃度約1μg/μL。立即進行下一步逆轉錄或凍存于-80℃冰箱中。
　　3、4使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒和miRNA-216b頸環(huán)引物，進行逆轉錄，每個樣品共獲得特殊的cDNA10μL，濃度約1μg/μL。再經(jīng)過RT-PCR法，測量出miR-216b在癌旁與癌組織的表達量，再經(jīng)過T檢驗，發(fā)現(xiàn)75％的原發(fā)性肝細胞癌患者的癌旁組織的miR-216b的表達量明顯高于癌組織，而

18、平均的表達量差異約為4.45倍，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　4、按照患者的miR-216b的癌組織中的表達量，和作為參照物的肝血管瘤患者正常肝組織標本中miR-216b的表達量對比，分為高表達組和低表達組。結合臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)miR-216b低表達組的腫瘤的明顯大于高表達組，門脈癌栓也明顯多于低表達組。兩組構成比進行卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。其余臨床病理資料，兩組間差異不明顯。
　　5、隨訪兩

19、組患者，發(fā)現(xiàn)miR-216b高表達組患者的術后五年總生存率和無瘤生存率分別是65％和57％，而 miR-216b低表達組的術后五年總生存率和無瘤生存率分別是37％和28％。兩組間差異明顯，具有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。
　　第四部分 miR-216b對于肝癌細胞系HepG2細胞和SMMC7721細胞增殖和侵襲能力的影響
　　實驗目的：研究miR-216b對于肝癌細胞系HepG2細胞和SMMC7721細胞增殖和侵襲能力的影響

20、
　　實驗方法：
　　1、RT-PCR法檢測肝細胞癌各細胞系中miR-216b的表達量，從中選擇出表達量最高和最低的進行下一步實驗。
　　2、在lipo2000介導下，進行RNA干擾，以miR-216b mimics轉染HepG2細胞，轉染后使用RT-PCR法檢測 miR-216b的表達。類似的步驟，以miR-216b inhibitor轉染SMCC-7721細胞，再用RT-PCR法檢測miR-216b的表達。

21、　　3、進行CCK-8實驗，檢測轉染后的HepG2細胞和SMCC-7721細胞的增殖能力。
　　4、進行軟瓊脂克隆形成實驗，檢測轉染后的HepG2細胞和SMCC-7721細胞的非錨定增殖能力。
　　5、進行劃痕實驗，檢測轉染后的HepG2細胞和SMCC-7721細胞的遷移能力。
　　6、進行Transwell實驗，檢測轉染后的HepG2細胞和SMCC-7721細胞的侵襲能力。
　　7、HepG2細胞和 SMCC-

22、7721細胞分成兩組，種植于裸鼠皮下，進行裸鼠皮下成瘤實驗。其中HepG2細胞組給予miRNA mimics瘤內注射，SMCC-7721細胞給予miRNA inhibitor瘤內注射。注射期間測量腫瘤的體積，三周后測量腫瘤的重量，在體內試驗中檢測miR-216b的作用。
　　實驗結果：
　　1、經(jīng)過RT-PCR檢測，miR-216b在肝癌細胞系中表達以 HepG2細胞為最低，以SMCC-7721細胞表達量為最高，所以選擇這兩

23、個細胞系進行下一步實驗。
　　2、轉染mimics后，與對照組相比較，miR-216b在HepG2中的表達明顯升高；轉染inhibitor后，與對照組相比較，miR-216b在SMCC-7721中的表達明顯降低。證明這兩個RNA干擾試劑的有效性。
　　3、經(jīng)過mimics轉染后，在7天內觀察HepG2細胞的增殖情況，第三天的時候，轉染組與對照組比較，它的增殖明顯受到增強，一直到第七天，增強程度逐漸增加，兩組間差異有統(tǒng)計學意義

24、(p<0.05）。經(jīng)過 inhibitor轉染后，在7天內觀察SMCC-7721細胞的增殖情況，第三天的時候，轉染組與對照組比較，它的增殖明顯受到抑制，一直到第七天，受抑制程度逐漸增加，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　4、經(jīng)過mimics轉染后，在兩周內觀察HepG2細胞的非錨定增殖情況，兩周后，轉染組與對照組比較，它所形成的的克隆的個數(shù)和大小都明顯大于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。經(jīng)過 inhib

25、itor轉染后，在兩周內觀察 SMCC-7721細胞的非錨定增殖情況，兩周后，轉染組與對照組比較，它所形成的的克隆的個數(shù)和大小都明顯小于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　5、經(jīng)過mimics轉染后，在48小時內觀察HepG2細胞移動能力，轉染組與對照組比較，它的劃痕的愈合速度明顯快于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。經(jīng)過inhibitor轉染后，在48小時內觀察SMCC-7721細胞的移動能力，轉

26、染組與對照組比較，它的劃痕的愈合速度明顯慢于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　6、經(jīng)過mimics轉染后，在48小時內觀察HepG2細胞通過matrigel的侵襲能力，轉染組與對照組比較，它進入到下層小室的細胞數(shù)明顯多于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。經(jīng)過inhibitor轉染后，在48小時內觀察SMCC-7721細胞通過matrigel的侵襲能力，轉染組與對照組比較，它進入到下層小室的細胞數(shù)明

27、顯少于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　7、裸鼠皮下移植瘤生長至21天，它的生長曲線發(fā)現(xiàn)，mimics組和inhibitor組的細胞形成的皮下瘤生長速度在21天后明顯低于和高于各自的對照組(p<0.01);第21天，mimics組腫瘤直徑(2.40士0.41cm3)和inhibitor組腫瘤直徑(1.60士0.21cm3)形成皮下瘤的平均體積與各自對照組腫瘤體積(1.19士0.29 cm3)和(2.07士0.2

28、4cm3)相比明顯減低(p　　第五部分 miR-216b對于肝癌細胞系HepG2細胞和SMMC7721細胞增殖和侵襲能力的影響的機制研究
　　實驗目

29、的：探討miR-216b對于肝癌細胞系HepG2細胞和SMMC7721細胞增殖和侵襲能力的影響的機制。
　　實驗方法：
　　1、因為miRNA主要作用于目的基因的3’UTR區(qū)域，從而影響該基因轉錄后的表達。使用miRbase等數(shù)據(jù)庫和算法，預測miR-216b的作用靶基因。
　　2、篩選出KRAS基因作為miR-216b的作用基因，預測miR-216b的結合位置和堿基序列。復制該基因3’UTR區(qū)域的全長序列，設計miR

30、NA的作用序列的變異序列，作為對照組，進行l(wèi)uciferase實驗，以確定miR-216b是否可與該序列特異性結合。分別使用mimics和inhibitor作用于該序列，觀察結果。
　　3、使用RT-PCR法和western blotting法檢測KRAS在轉染mimics或inhibitor后的mRNA表達水平和蛋白表達水平。
　　4、使用RNA干擾技術，篩選出合適位點的KRAS基因的干擾基因，經(jīng)過瞬轉敲除KRAS的表達后

31、，再加入miR-216b的mimics和inhibitor，觀察敲除KRAS后對HepG2和SMCC-7721細胞增殖的影響。
　　5、miR-216b敲除或者過表達后，研究KRAS的下游基因，進一步研究miR-216b的作用機理。
　　實驗結果：
　　1、經(jīng)過多個網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫和算法預測，其中五個數(shù)據(jù)庫預測miR-216b可以作用在KRAS基因的3’UTR區(qū)，從而影響KRAS的蛋白表達，繼而影響它的下游通路，影響肝癌細胞

32、的增殖和轉移。
　　2、經(jīng)過luciferase實驗，發(fā)現(xiàn)miR-216b的mimics和inhibitor可以作用在KRAS基因的3’UTR區(qū)的特異位點，而該位點突變后，mimics和inhibitor對于3’UTR區(qū)的結合被抑制。
　　3、使用miR-216b的mimics轉染HepG2細胞，可以降低KRAS基因的蛋白表達量，與對照組見有明顯差異，而對于KRAS的mRNA表達水平無明顯影響，說明miR-216b是作用于K

33、RAS的轉錄后過程。使用miR-216b的inhibitor轉染SMCC-7721細胞，可以升高KRAS基因的蛋白表達量，與對照組見有明顯差異，而對于KRAS的mRNA表達水平無明顯影響，進一步說明miR-216b是作用于KRAS的轉錄后過程。
　　4、敲除KRAS基因后，miR-216b的mimics和inhibitor對于HepG2細胞和SMCC-7721細胞的增殖的抑制和促進作用消失，與對照組的增殖無明顯統(tǒng)計學差異。說明mi

34、R-216b發(fā)揮抑制肝癌細胞的增殖作用，主要靠KRAS發(fā)揮作用。
　　5、使用miR-216b的mimics轉染HepG2細胞，可以降低KRAS下游p-AKT和p-ERK的表達。使用miR-216b的inhibitor轉染SMCC-7721細胞，可以升高KRAS下游的p-AKT和p-ERK的表達。從而說明miR-216b對于肝癌增殖和轉移能力的產(chǎn)生影響的信號通路。
　　統(tǒng)計學分析
　　所有的實驗所得的結果都要重復三次，

35、前文所提到的所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差的形式來表示，同時應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組組間差異采用t檢驗或單因素方差分析(ANOVA)，而分類變量的比較一般采用卡方檢驗，使用Kaplan Meier法對生存率進行分析，認定p<0.05為差異有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　結論
　　1、miR-216b在原發(fā)性肝細胞癌家族史患者的血漿中的表達量明顯低于健康志愿者。
　　2、miR-216b在原發(fā)性肝細胞癌患者的癌組

36、織中的表達明顯低于癌旁肝臟組織中的表達。而且miR-216b在癌組織中的表達量高低與患者的腫瘤大小、門脈癌栓的有無以及術后的預后密切相關。
　　3、抑制或者過表達miR-216b可以在體外細胞實驗和裸鼠體內細胞成瘤實驗中，影響肝癌細胞系的增殖。
　　4、抑制或者過表達miR-216b可以在體外細胞實驗中影響肝癌細胞系的運動和侵襲能力。
　　5、miR-216b主要靠直接作用于KRAS基因，通過PI3K/ERK和AKT通