XRCC2分子在人肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機制研究.pdf

1、第一部分研究肝癌組織與癌周肝組織中DNA損傷修復分子的表達差異
　　實驗目的：探索肝癌組織和癌周肝組織中DNA損傷修復分子的表達差異。
　　實驗方法：
　　1．收集肝癌肝切除術病人的癌組織和癌周肝組織。篩選年齡在40歲左右的男性病人，有乙肝病史，且腫瘤最大直徑<5cm，經術后病理診斷為原發(fā)性肝癌，且分化程度一致的病例，將剛切除下來的標本快速放入凍存管中，加入RNA保存液(RNA wa it)，放入-80℃冰箱中保存。<

2、br>　　2．將收集的肝癌組織和癌周肝組織裝入含有干冰的低溫罐中，送上海伯豪生物有限公司。采用Agilent人全基因譜表達芯片檢測肝癌組織和癌周肝組織中DNA損傷修復基因的表達差異。
　　實驗結果：
　　1.共收集3例符合條件的肝癌病人的癌組織和癌周肝組織。
　　2.芯片結果發(fā)現(xiàn)有33個在肝癌組織和癌周肝組織中差異表達的DNA損傷修復的分子，其中有8個表達差異均在10倍以上。其中XRCC2分子在肝癌中尚未報道，其癌組織

3、中的表達比癌周肝組織表達高出17.5倍。
　　第二部分研究XRCC2分子的表達與肝癌病人臨床病理特征和肝切除術后遠期療效的相關性
　　實驗目的：擴大樣本量驗證XRCC2分子在肝癌組織和癌周肝組織之間的表達是否存在差異，并且分析其表達與病人臨床病理特征及預后之間的關系。
　　實驗方法：
　　1.從我院肝癌標本庫中選擇2009年1月至2011年1月實施肝切除的肝癌病人的癌組織和癌周肝組織共149對。采用RT-PCR、

4、Western blot和免疫組織化學技術檢測其癌組織和癌周肝組織中XRCC2分子的表達情況。
　　2.收集整理病人的臨床病理資料并進行術后隨訪，分析XRCC2分子的表達與肝癌惡性生物學特性的關系及其對肝癌病人肝切除術后遠期療效的影響。
　　實驗結果：
　　1. RT-PCR結果顯示有111例(74.5％)肝癌病人癌組織中XRCC2分子的表達明顯高于其癌周肝組織。免疫組織化學和Western blot隨機檢測上述50對

5、肝癌組織和癌周肝組織中XRCC2分子在蛋白水平的表達，也發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達明顯高于對應的癌周肝組織。
　　2.根據XRCC2分子在肝癌病人癌組織中相對于癌周肝組織中的表達量，我們將149例肝癌病人分為高表達組(n=111例)和低表達組(n=38例)。結合病人的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)XRCC2分子表達水平與HBV-DNA滴度、肝硬化程度重、腫瘤分化程度、腫瘤大小及有無包膜密切相關。
　　3.對兩組病人進行術后隨訪，發(fā)現(xiàn)XRCC

6、2高表達組病人肝切除術后5年總體生存率和無瘤生存率均明顯低于 XRCC2低表達組的病人，分別為28.7%、17.8%和54.2%、37.6%，兩組之間具有顯著的統(tǒng)計學差異(p<0.01)。Cox風險比例回歸分析顯示，XRCC2分子的表達水平是影響肝癌肝切除術后總體生存和無瘤生存的獨立危險因子。
　　第三部分研究XRCC2分子對Bel-7402和SMMC-7721兩種肝癌細胞增殖能力的影響
　　實驗目的：探討XRCC2分子對B

7、el-7402和SMMC-7721兩種肝癌細胞系增殖能力的影響。
　　實驗方法：
　　1.采用 RT-PCR和 Western blot的方法檢測10種肝癌細胞系和正常肝細胞系中XRCC2分子的表達情況，從中挑選出XRCC2分子的表達量最高和最低的肝癌細胞系進行下一步實驗。
　　2.利用shRNA慢病毒轉染技術下調肝癌細胞系Bel-7402中XRCC2分子的表達，以過表達慢病毒轉染技術上調肝癌細胞系SMMC-7721中

8、XRCC2分子的表達，兩種慢病毒均攜帶有嘌呤霉素抗性基因，從轉染后第2天開始，用濃度為5μg/mL的嘌呤霉素篩選陽性細胞，然后采用Western blot和RT-PCR檢測上述細胞中XRCC2分子的表達情況。
　　3.采用 CCK-8實驗、平板克隆形成實驗及軟瓊脂克隆形成實驗，檢測轉染前后Bel-7402細胞核 SMMC-7721細胞的體外增殖成瘤能力；利用 Edu熒光檢測Bel-7402細胞轉染前后 Edu染核的陽性比例來進一步

9、證實 XRCC2分子在肝癌細胞增殖中的作用。
　　4.將Bel-7402和SMMC-7721兩種細胞轉染前后的細胞分別種植到4周左右的裸鼠皮下，5×106個細胞/只，每組10只，觀察和記錄各組細胞種植瘤的瘤體的生長變化，每4天記錄一次，32天后處死小鼠，取下腫瘤并稱重，測量腫瘤的大小，繪制瘤體生長曲線。
　　實驗結果：
　　1. Western blot和RT-PCR結果表明，與正常肝細胞系相比，10中常見肝癌細胞系中

10、XRCC2的表達明顯升高，其中Bel-7402表達最高，SMMC-7721表達最低，因此，這兩種細胞用于后續(xù)實驗。
　　2. Western blot和RT-PCR檢測敲減和過表達的效率，結果表明Bel-7402細胞中XRCC2分子的抑制率約為75%，SMMC-7721細胞中XRCC2分子表達上升約32倍，成功建立敲減和過表達的Bel-7402-sh-XRCC2和SMMC-7721-XRCC2肝癌細胞株以及僅轉染空載體的Bel-7

11、402-vec和SM MC-7721-vec對照細胞株。
　　3. CCK-8實驗結果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組與 Bel-7402-vec組相比，從第三天開始，OD450值明顯下降(0.45±0.098 vs1.16±0.21, p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，從培養(yǎng)的第三天開始，OD450值明顯升高(1.56±0.18 vs0.72±0.11, p<0.01)

12、；平板克隆實驗結果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，在連續(xù)培養(yǎng)12天后，其克隆形成數明顯下降(145±16個 vs344±24個, p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，克隆形成數明顯升高(582±32個 vs410±21個, p<0.05)；瓊脂糖克隆形成實驗結果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，在連續(xù)培養(yǎng)

13、18天后，其克隆形成數明顯下降(49±6個 vs117±9個, p<0.01)，SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，克隆形成數明顯升高(128±10個vs81±7個, p<0.01)。Ed u免疫熒光結果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，Edu核染色的比例下降約5倍。
　　4.裸鼠皮下種植瘤實驗結果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402

14、-vec組相比，腫瘤生長速度明顯緩慢，到第32天實驗終止時，XRCC2敲減組瘤體大小(0.26±0.05cm3 vs0.86±0.19cm3)和重量(0.44±0.08g vs0.11±0.01g)均明顯下降(p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，腫瘤生長速度明顯增加，實驗終止時，其瘤體大小(1.82±0.19cm3 vs1.14±0.28cm3)和重量(1.32±0.12g vs0.54±

15、0.09 g)均明顯增高(p<0.01)。
　　第四部分研究XRCC2分子調控肝癌細胞Bel-7402和SMMC-7721增殖能力的分子機制
　　實驗目的：探討XRCC2分子調控肝癌細胞系Bel-7402和SMMC-7721增殖能力的可能分子機制。
　　實驗方法：
　　1.流式細胞術分別檢測肝癌細胞 Bel-7402-vec、Bel-7402-sh-XRCC2和肝癌細胞SMMC-7721-vec、SMMC-772

16、1-XRCC2的細胞周期分布情況。
　　2.流式細胞術分別檢測肝癌細胞 Bel-7402-vec和下調 XRCC2分子表達的細胞Bel-7402-sh-XRCC2凋亡水平的變化。
　　3. RT-PCR和 Western blot技術檢測 Bel-7402-vec、Bel-7402-sh-XRCC2和SMMC-7721-vec、SMMC-7721-XRCC2四種肝癌細胞的細胞周期和凋亡相關蛋白的表達水平。
　　4.免疫

17、組織化學檢測各組裸鼠皮下種植瘤組織中細胞周期蛋白的表達水平；TUN EL法檢測各組裸鼠皮下種植瘤組織中細胞凋亡水平。
　　實驗結果：
　　1.流式細胞術檢測細胞周期分布顯示，Bel-7402-vector組細胞 S期所占的比例為10.46%±2.09%，Bel-7402-sh-XRCC2組細胞S期所占的比例為41.08%±3.17%，兩組細胞的S期比例差異均具有明顯的統(tǒng)計學意義(p<0.01);SMMC-7721-vecto

18、r細胞S期所占比例為28.87%±2.37%，SMMC-7721-XRCC2細胞S期所占比例為15.65%±2.23%，兩組細胞的S期比例差異均具有明顯的統(tǒng)計學意義(p<0.01)。
　　2.流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，Bel-7402-vector組細胞凋亡的比例約為1.36%±0.54%，Bel-7402-sh-XRCC2組細胞中凋亡細胞所占的比例為9.8%±1.1%，下調 XRCC2分子表達后，肝癌細胞的凋亡率明顯上升，

19、差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　3. RT-PCR及Western blot結果顯示，肝癌細胞Bel-7402下調XRCC2分子的表達后，Rad51、p53、p21和p15等細胞周期調控因子表達升高，MDM4、PARP-1、cyc linD1和CDK2/4等細胞周期調控蛋白表達下降；促凋亡因子 Bax、Caspase-3和c-myc表達升高，而抑凋亡因子Bcl-2表達下降。肝癌細胞SMMC-7721上調XRCC2分子的表達

20、后，MDM4、PARP-1、CDK4和cyclinD1等細胞周期調控因子表達升高，p53、p21表達下降，凋亡因子Bax、 Caspase-3、c-myc和Bcl-2的表達未見明顯改變。
　　4.免疫組織化學檢測種植瘤組織中相應蛋白的表達結果與 Western blot檢測細胞中蛋白表達的結果一致。Ki67染色結果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組的核染陽性細胞數明顯低于對照組，TUN EL法檢測兩種組織中的凋亡率，結果顯

21、示Bel-7402-sh-XRCC2組凋亡率明顯高于對照組(11.8%±2.8% vs2.6%±1.0%, p<0.01)。
　　第五部分研究XRCC2分子的表達在肝癌化療中的作用
　　實驗目的：探討抑制XRCC2分子的表達能否增加肝癌對米諾環(huán)素的化療敏感性。實驗方法：
　　1. CCK-8實驗和平板克隆實驗檢測Bel-7402-vec和Bel-7402-sh-XRCC2兩種肝癌細胞分別給予200μM米諾環(huán)素處理前后的

22、增殖情況的變化。
　　2.將Bel-7402-vec和Bel-7402-sh-XRCC2兩種肝癌細胞以5x106個細胞/只，每組12只，接種到4周齡裸鼠腋部皮下，待皮下種植瘤長到100 mm3時，再分為兩組，一組腹腔注射米諾環(huán)素，劑量為20mg/Kg/只，3次/周；另一組腹腔注射等量生理鹽水，觀察各組細胞皮下種植瘤的生長情況，并記錄，40天后處死各實驗組小鼠，剝離瘤體，稱重，測量體積，繪制瘤體生長曲線，比較各組種植瘤的大小和重量變

23、化。
　　實驗結果：
　　1. CCK-8實驗結果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組與 Bel-7402-vec組相比，從第二天開始，其 OD450值明顯下降(0.48±0.08 vs0.93±0.11, p<0.01)；Bel-7402-vec組與Bel-7402-vec+mino組相比，連續(xù)培養(yǎng)5天后 OD450值無明顯差異；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與 Bel-7402-sh-XRCC2組相

24、比，從第三天開始，其OD450值明顯下降(0.39±0.07 vs0.63±0.14, p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與Bel-7402-vec+mino組相比，從第三天開始，其 OD450值明顯下降(0.39±0.07 vs1.07±0.12, p<0.01)。平板克隆實驗結果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組細胞與Bel-7402-vec組細胞相比，在連續(xù)培養(yǎng)14天后，其克隆形成數明顯下降(1

25、24±16個vs208±21個, p<0.01)；Bel-7402-vec組細胞與Bel-7402-vec+mino相比，其克隆形成數無明顯差異(208±21個vs189±18個)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組細胞與Bel-7402-sh-XRCC2組細胞相比，其克隆形成數明顯下降(74±9個 vs124±16個, p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組細胞與 Bel-7402-vec+mino

26、組細胞相比，其克隆形成數明顯下降(74±9個vs189±18個, p<0.01)。
　　2.裸鼠皮下種植瘤生長至第40天，結果發(fā)現(xiàn)，Bel-7402-vec組與Bel-7402-vec+mino組相比，瘤體大小(2.44±0.35cm3 vs2.21±0.29cm3)和重量(0.75±0.083g vs0.66±0.075g)無明顯差異;Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，瘤體大小(0.78±0.

27、19cm3 vs2.44±0.35cm3)和重量(0.24±0.032g vs0.75±0.083g)均明顯下降(p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與 Bel-7402-vec+mino組相比，瘤體大小(0.32±0.065cm3 vs2.21±0.29cm3)和重量(0.11±0.023g vs0.66±0.075g)均明顯下降(p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與 Bel-74

28、02-sh-XRCC2組相比，瘤體大小(0.32±0.065cm3 vs0.78±0.19cm3)和瘤體重量(0.11±0.023g vs0.24±0.032g)均明顯下降(p<0.01)。
　　統(tǒng)計學分析
　　病例資料中的連續(xù)變量的數據采用均數±標準差的形式表示，分類變量數據采用百分比的形式表示,采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)變量之間的差異采用t檢驗或單因素方差分析，分類變量之間的差異采用卡方檢驗，生存分析采

29、用Kaplan Meier法對兩組之間的預后進行分析比較?；A實驗數據所得的數據均獨立重復3次以上，認定p<0.05為差異有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　結論
　　1. XRCC2分子在肝癌組織中表達明顯高于對應的癌周肝組織，且XRCC2分子的表達與肝癌肝切除術后遠期療效呈反比關系。
　　2.肝癌細胞系中XRCC2分子普遍高表達，下調肝癌細胞中XRCC2分子的表達可明顯抑制肝癌的增殖能力。
　　3.下調肝癌細胞中 XR