XRCC2分子在人肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分研究肝癌組織與癌周肝組織中DNA損傷修復(fù)分子的表達(dá)差異
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾剿鞲伟┙M織和癌周肝組織中DNA損傷修復(fù)分子的表達(dá)差異。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1．收集肝癌肝切除術(shù)病人的癌組織和癌周肝組織。篩選年齡在40歲左右的男性病人，有乙肝病史，且腫瘤最大直徑<5cm，經(jīng)術(shù)后病理診斷為原發(fā)性肝癌，且分化程度一致的病例，將剛切除下來的標(biāo)本快速放入凍存管中，加入RNA保存液(RNA wa it)，放入-80℃冰箱中保存。<

2、br>　　2．將收集的肝癌組織和癌周肝組織裝入含有干冰的低溫罐中，送上海伯豪生物有限公司。采用Agilent人全基因譜表達(dá)芯片檢測肝癌組織和癌周肝組織中DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.共收集3例符合條件的肝癌病人的癌組織和癌周肝組織。
　　2.芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)有33個(gè)在肝癌組織和癌周肝組織中差異表達(dá)的DNA損傷修復(fù)的分子，其中有8個(gè)表達(dá)差異均在10倍以上。其中XRCC2分子在肝癌中尚未報(bào)道，其癌組織

3、中的表達(dá)比癌周肝組織表達(dá)高出17.5倍。
　　第二部分研究XRCC2分子的表達(dá)與肝癌病人臨床病理特征和肝切除術(shù)后遠(yuǎn)期療效的相關(guān)性
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簲U(kuò)大樣本量驗(yàn)證XRCC2分子在肝癌組織和癌周肝組織之間的表達(dá)是否存在差異，并且分析其表達(dá)與病人臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.從我院肝癌標(biāo)本庫中選擇2009年1月至2011年1月實(shí)施肝切除的肝癌病人的癌組織和癌周肝組織共149對。采用RT-PCR、

4、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測其癌組織和癌周肝組織中XRCC2分子的表達(dá)情況。
　　2.收集整理病人的臨床病理資料并進(jìn)行術(shù)后隨訪，分析XRCC2分子的表達(dá)與肝癌惡性生物學(xué)特性的關(guān)系及其對肝癌病人肝切除術(shù)后遠(yuǎn)期療效的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. RT-PCR結(jié)果顯示有111例(74.5％)肝癌病人癌組織中XRCC2分子的表達(dá)明顯高于其癌周肝組織。免疫組織化學(xué)和Western blot隨機(jī)檢測上述50對

5、肝癌組織和癌周肝組織中XRCC2分子在蛋白水平的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達(dá)明顯高于對應(yīng)的癌周肝組織。
　　2.根據(jù)XRCC2分子在肝癌病人癌組織中相對于癌周肝組織中的表達(dá)量，我們將149例肝癌病人分為高表達(dá)組(n=111例)和低表達(dá)組(n=38例)。結(jié)合病人的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)XRCC2分子表達(dá)水平與HBV-DNA滴度、肝硬化程度重、腫瘤分化程度、腫瘤大小及有無包膜密切相關(guān)。
　　3.對兩組病人進(jìn)行術(shù)后隨訪，發(fā)現(xiàn)XRCC

6、2高表達(dá)組病人肝切除術(shù)后5年總體生存率和無瘤生存率均明顯低于 XRCC2低表達(dá)組的病人，分別為28.7%、17.8%和54.2%、37.6%，兩組之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析顯示，XRCC2分子的表達(dá)水平是影響肝癌肝切除術(shù)后總體生存和無瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。
　　第三部分研究XRCC2分子對Bel-7402和SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慩RCC2分子對B

7、el-7402和SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞系增殖能力的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.采用 RT-PCR和 Western blot的方法檢測10種肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中XRCC2分子的表達(dá)情況，從中挑選出XRCC2分子的表達(dá)量最高和最低的肝癌細(xì)胞系進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.利用shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)肝癌細(xì)胞系Bel-7402中XRCC2分子的表達(dá)，以過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中

8、XRCC2分子的表達(dá)，兩種慢病毒均攜帶有嘌呤霉素抗性基因，從轉(zhuǎn)染后第2天開始，用濃度為5μg/mL的嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞，然后采用Western blot和RT-PCR檢測上述細(xì)胞中XRCC2分子的表達(dá)情況。
　　3.采用 CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測轉(zhuǎn)染前后Bel-7402細(xì)胞核 SMMC-7721細(xì)胞的體外增殖成瘤能力；利用 Edu熒光檢測Bel-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后 Edu染核的陽性比例來進(jìn)一步

9、證實(shí) XRCC2分子在肝癌細(xì)胞增殖中的作用。
　　4.將Bel-7402和SMMC-7721兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞分別種植到4周左右的裸鼠皮下，5×106個(gè)細(xì)胞/只，每組10只，觀察和記錄各組細(xì)胞種植瘤的瘤體的生長變化，每4天記錄一次，32天后處死小鼠，取下腫瘤并稱重，測量腫瘤的大小，繪制瘤體生長曲線。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. Western blot和RT-PCR結(jié)果表明，與正常肝細(xì)胞系相比，10中常見肝癌細(xì)胞系中

10、XRCC2的表達(dá)明顯升高，其中Bel-7402表達(dá)最高，SMMC-7721表達(dá)最低，因此，這兩種細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2. Western blot和RT-PCR檢測敲減和過表達(dá)的效率，結(jié)果表明Bel-7402細(xì)胞中XRCC2分子的抑制率約為75%，SMMC-7721細(xì)胞中XRCC2分子表達(dá)上升約32倍，成功建立敲減和過表達(dá)的Bel-7402-sh-XRCC2和SMMC-7721-XRCC2肝癌細(xì)胞株以及僅轉(zhuǎn)染空載體的Bel-7

11、402-vec和SM MC-7721-vec對照細(xì)胞株。
　　3. CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組與 Bel-7402-vec組相比，從第三天開始，OD450值明顯下降(0.45±0.098 vs1.16±0.21, p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，從培養(yǎng)的第三天開始，OD450值明顯升高(1.56±0.18 vs0.72±0.11, p<0.01)

12、；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，在連續(xù)培養(yǎng)12天后，其克隆形成數(shù)明顯下降(145±16個(gè) vs344±24個(gè), p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，克隆形成數(shù)明顯升高(582±32個(gè) vs410±21個(gè), p<0.05)；瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，在連續(xù)培養(yǎng)

13、18天后，其克隆形成數(shù)明顯下降(49±6個(gè) vs117±9個(gè), p<0.01)，SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，克隆形成數(shù)明顯升高(128±10個(gè)vs81±7個(gè), p<0.01)。Ed u免疫熒光結(jié)果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，Edu核染色的比例下降約5倍。
　　4.裸鼠皮下種植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402

14、-vec組相比，腫瘤生長速度明顯緩慢，到第32天實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，XRCC2敲減組瘤體大小(0.26±0.05cm3 vs0.86±0.19cm3)和重量(0.44±0.08g vs0.11±0.01g)均明顯下降(p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2組與SMMC-7721-vec組相比，腫瘤生長速度明顯增加，實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，其瘤體大小(1.82±0.19cm3 vs1.14±0.28cm3)和重量(1.32±0.12g vs0.54±

15、0.09 g)均明顯增高(p<0.01)。
　　第四部分研究XRCC2分子調(diào)控肝癌細(xì)胞Bel-7402和SMMC-7721增殖能力的分子機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慩RCC2分子調(diào)控肝癌細(xì)胞系Bel-7402和SMMC-7721增殖能力的可能分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)分別檢測肝癌細(xì)胞 Bel-7402-vec、Bel-7402-sh-XRCC2和肝癌細(xì)胞SMMC-7721-vec、SMMC-772

16、1-XRCC2的細(xì)胞周期分布情況。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)分別檢測肝癌細(xì)胞 Bel-7402-vec和下調(diào) XRCC2分子表達(dá)的細(xì)胞Bel-7402-sh-XRCC2凋亡水平的變化。
　　3. RT-PCR和 Western blot技術(shù)檢測 Bel-7402-vec、Bel-7402-sh-XRCC2和SMMC-7721-vec、SMMC-7721-XRCC2四種肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　4.免疫

17、組織化學(xué)檢測各組裸鼠皮下種植瘤組織中細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平；TUN EL法檢測各組裸鼠皮下種植瘤組織中細(xì)胞凋亡水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布顯示，Bel-7402-vector組細(xì)胞 S期所占的比例為10.46%±2.09%，Bel-7402-sh-XRCC2組細(xì)胞S期所占的比例為41.08%±3.17%，兩組細(xì)胞的S期比例差異均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01);SMMC-7721-vecto

18、r細(xì)胞S期所占比例為28.87%±2.37%，SMMC-7721-XRCC2細(xì)胞S期所占比例為15.65%±2.23%，兩組細(xì)胞的S期比例差異均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，Bel-7402-vector組細(xì)胞凋亡的比例約為1.36%±0.54%，Bel-7402-sh-XRCC2組細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的比例為9.8%±1.1%，下調(diào) XRCC2分子表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的凋亡率明顯上升，

19、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　3. RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞Bel-7402下調(diào)XRCC2分子的表達(dá)后，Rad51、p53、p21和p15等細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)升高，MDM4、PARP-1、cyc linD1和CDK2/4等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)下降；促凋亡因子 Bax、Caspase-3和c-myc表達(dá)升高，而抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)下降。肝癌細(xì)胞SMMC-7721上調(diào)XRCC2分子的表達(dá)

20、后，MDM4、PARP-1、CDK4和cyclinD1等細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)升高，p53、p21表達(dá)下降，凋亡因子Bax、 Caspase-3、c-myc和Bcl-2的表達(dá)未見明顯改變。
　　4.免疫組織化學(xué)檢測種植瘤組織中相應(yīng)蛋白的表達(dá)結(jié)果與 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá)的結(jié)果一致。Ki67染色結(jié)果顯示，Bel-7402-sh-XRCC2組的核染陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，TUN EL法檢測兩種組織中的凋亡率，結(jié)果顯

21、示Bel-7402-sh-XRCC2組凋亡率明顯高于對照組(11.8%±2.8% vs2.6%±1.0%, p<0.01)。
　　第五部分研究XRCC2分子的表達(dá)在肝癌化療中的作用
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接懸种芚RCC2分子的表達(dá)能否增加肝癌對米諾環(huán)素的化療敏感性。實(shí)驗(yàn)方法：
　　1. CCK-8實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測Bel-7402-vec和Bel-7402-sh-XRCC2兩種肝癌細(xì)胞分別給予200μM米諾環(huán)素處理前后的

22、增殖情況的變化。
　　2.將Bel-7402-vec和Bel-7402-sh-XRCC2兩種肝癌細(xì)胞以5x106個(gè)細(xì)胞/只，每組12只，接種到4周齡裸鼠腋部皮下，待皮下種植瘤長到100 mm3時(shí)，再分為兩組，一組腹腔注射米諾環(huán)素，劑量為20mg/Kg/只，3次/周；另一組腹腔注射等量生理鹽水，觀察各組細(xì)胞皮下種植瘤的生長情況，并記錄，40天后處死各實(shí)驗(yàn)組小鼠，剝離瘤體，稱重，測量體積，繪制瘤體生長曲線，比較各組種植瘤的大小和重量變

23、化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組與 Bel-7402-vec組相比，從第二天開始，其 OD450值明顯下降(0.48±0.08 vs0.93±0.11, p<0.01)；Bel-7402-vec組與Bel-7402-vec+mino組相比，連續(xù)培養(yǎng)5天后 OD450值無明顯差異；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與 Bel-7402-sh-XRCC2組相

24、比，從第三天開始，其OD450值明顯下降(0.39±0.07 vs0.63±0.14, p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與Bel-7402-vec+mino組相比，從第三天開始，其 OD450值明顯下降(0.39±0.07 vs1.07±0.12, p<0.01)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bel-7402-sh-XRCC2組細(xì)胞與Bel-7402-vec組細(xì)胞相比，在連續(xù)培養(yǎng)14天后，其克隆形成數(shù)明顯下降(1

25、24±16個(gè)vs208±21個(gè), p<0.01)；Bel-7402-vec組細(xì)胞與Bel-7402-vec+mino相比，其克隆形成數(shù)無明顯差異(208±21個(gè)vs189±18個(gè))；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組細(xì)胞與Bel-7402-sh-XRCC2組細(xì)胞相比，其克隆形成數(shù)明顯下降(74±9個(gè) vs124±16個(gè), p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組細(xì)胞與 Bel-7402-vec+mino

26、組細(xì)胞相比，其克隆形成數(shù)明顯下降(74±9個(gè)vs189±18個(gè), p<0.01)。
　　2.裸鼠皮下種植瘤生長至第40天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bel-7402-vec組與Bel-7402-vec+mino組相比，瘤體大小(2.44±0.35cm3 vs2.21±0.29cm3)和重量(0.75±0.083g vs0.66±0.075g)無明顯差異;Bel-7402-sh-XRCC2組與Bel-7402-vec組相比，瘤體大小(0.78±0.

27、19cm3 vs2.44±0.35cm3)和重量(0.24±0.032g vs0.75±0.083g)均明顯下降(p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與 Bel-7402-vec+mino組相比，瘤體大小(0.32±0.065cm3 vs2.21±0.29cm3)和重量(0.11±0.023g vs0.66±0.075g)均明顯下降(p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino組與 Bel-74

28、02-sh-XRCC2組相比，瘤體大小(0.32±0.065cm3 vs0.78±0.19cm3)和瘤體重量(0.11±0.023g vs0.24±0.032g)均明顯下降(p<0.01)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　病例資料中的連續(xù)變量的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，分類變量數(shù)據(jù)采用百分比的形式表示,采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)變量之間的差異采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，分類變量之間的差異采用卡方檢驗(yàn)，生存分析采

29、用Kaplan Meier法對兩組之間的預(yù)后進(jìn)行分析比較。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得的數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)3次以上，認(rèn)定p<0.05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1. XRCC2分子在肝癌組織中表達(dá)明顯高于對應(yīng)的癌周肝組織，且XRCC2分子的表達(dá)與肝癌肝切除術(shù)后遠(yuǎn)期療效呈反比關(guān)系。
　　2.肝癌細(xì)胞系中XRCC2分子普遍高表達(dá)，下調(diào)肝癌細(xì)胞中XRCC2分子的表達(dá)可明顯抑制肝癌的增殖能力。
　　3.下調(diào)肝癌細(xì)胞中 XR