BIRC6在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究及其分子機制研究.pdf

1、在多細胞生物中，細胞通過有絲分裂途徑產(chǎn)生細胞的效應和通過凋亡途徑誘導的細胞死亡構成一種動態(tài)平衡。這種精細平衡的破壞會導致腫瘤的發(fā)生。已有明確報道凋亡逃逸或者對細胞死亡的抵抗是腫瘤的標志之一。既往研究證實，凋亡抑制蛋白家族（inhibitors ofapoptosis protein，IAPs）是細胞內(nèi)的一群結構和功能相似的蛋白，是胞質(zhì)分裂、凋亡和信號傳導的關鍵調(diào)節(jié)因子。IAP家族有8個成員:Neuronal Apoptosis Inhi

2、bitory Protein(BIRC1/NAIP),Cellular-IAP1(BIRC2/HIAP2/c-IAP1), Cellular-IAP2(BIRC3/HIAP1/c-IAP2), X-linked IAP(XIAP/BIRC4), Survivin(BIRC5), Apollon(BIRC6), Livin(BIRC7/KIAP/ML-IAP)和IAP-like Protein-2(BIRC8/ILP-2)?，F(xiàn)有研究表明，

3、BIRC6與腦癌、乳腺癌、結腸癌、幼兒急性淋巴細胞白血病、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后相關，但至今鮮有BIRC6和肝細胞癌之間關系的報道。因此，本研究的目的是明確BIRC6在原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的作用，并進一步探討其分子作用機制。本論文分成三個部分:
　　第一部分 BIRC6表達與人肝癌臨床病理特征的關系及其對肝癌發(fā)生與預后的影響
　　我們采用Western

4、blot方法檢測了BIRC6在40對癌和癌旁組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)BIRC6在癌組織中的表達上調(diào)明顯高于癌旁組織，經(jīng)配對t檢驗驗證有統(tǒng)計學差異。同時采用免疫組化染色方法檢測了BIRC6在160例肝癌組織和相應癌旁組織中的表達情況，結果也表明BIRC6在肝癌組織中呈高表達且高于癌旁組織，存在統(tǒng)計學差異。我們利用x2檢驗或Fisher's精確概率法分析所得BIRC6在癌組織中的表達與ALT、血管侵襲及TNM分級這三個HCC危險因素相關。用K

5、aplan-Meier(log-rank檢驗)法進行生存分析發(fā)現(xiàn)在癌組織中BIRC6表達量高的患者術后生存期短且復發(fā)率高于表達量低的患者。隨后，我們采用Cox風險比例模型，對HCC患者術后總體生存(overall survival，OS)和至復發(fā)時間(time to recurrence，TTR)的相關危險因素分別進行單因素和多因素分析。結果顯示，BIRC6在癌組織中的表達情況是影響肝癌患者根治術后OS及TTR的獨立危險因素。這一部分研

6、究提示，BIRC6可能是一個新的HCC預后標志物。
　　第二部分 BIRC6在肝癌發(fā)生發(fā)展中的腫瘤生物學行為
　　本研究部分利用shRNA-BIRC6慢病毒顆粒構建了BIRC6下調(diào)的穩(wěn)定細胞株，并對其進行了體外細胞功能實驗和體內(nèi)裸鼠成瘤實驗研究。結果顯示，與對照相比，BIRC6下調(diào)能顯著抑制細胞增殖和細胞周期，促進細胞凋亡，同時在裸鼠體內(nèi)抑制腫瘤形成，并且能夠與腫瘤靶向治療藥物索拉菲尼構成協(xié)同作用。由此說明，BIRC6具有促

7、進肝癌細胞增殖和腫瘤形成的能力，結合第一部分的臨床研究結果，提示BIRC6在肝癌組織中表達的增高可能是肝癌術后預后不良的原因。
　　第三部分 BIRC6促進肝癌發(fā)生的相關機制探討
　　p53作為經(jīng)典的腫瘤抑制基因，在腫瘤增殖和死亡（凋亡）的過程中發(fā)揮了極為關鍵的作用。p53的異常在幾乎所有癌癥細胞中存在，是腫瘤發(fā)病機理的常見機制之一。其異常通常由p53基因突變/缺失及基因表達或功能的異常調(diào)控所致。p53蛋白的活性、表達和定位

8、主要受轉錄后修飾，例如磷酸化、乙酰化和泛素化作用等。既往文獻報道，BIRC6結構中C末端的泛素連接酶區(qū)域(UBC，ubiquitin-conjugating enzyme domain)及N末端的棒狀病毒凋亡抑制蛋白重復結構區(qū)域（BIR，baculovirus inhibition of apoptosis protein repeat domain）賦予了BIRC6作為E2/E3連接酶的特性，由此連結底物SMAC及caspase-9從

9、而促使其泛素化而降解。另有文獻報道p53是BIRC6的下游效應基因，BIRC6基因下調(diào)后可通過增加p53的穩(wěn)定性而誘導凋亡，但是BIRC6究竟是怎樣影響P53的穩(wěn)定性的還未得而知。考慮到BIRC6本身是一種E2/E3連接酶，我們推測其可能會同Mdrn2、COP1或Pirh等p53的主要調(diào)控因子類似，直接催化p53的泛素化及蛋白酶降解途徑。因此在本研究部分中，我們探討B(tài)IRC6與p53之間是否存在直接相互作用，并且如何實現(xiàn)這種相互作用。一

10、方面，我們應用免疫共沉淀技術及激光共聚焦技術證實了BIRC6和p53之間存在相互作用，另一方面，我們通過泛素化實驗證實了BIRC6通過泛素-蛋白酶體途徑促進p53的降解。
　　綜上所述，通過本研究，我們首次明確了BIRC6具有促進肝癌細胞增殖和腫瘤發(fā)生的作用，并且是影響肝癌患者根治術后OS及TTR的獨立危險因素。此外，我們明確了BIRC6通過泛素化-蛋白酶體途徑降低p53表達進而對抗凋亡作用并促進腫瘤發(fā)生。因此，BIRC6可以作為