TMEM67在隱性多囊腎發(fā)生發(fā)展中的相關分子機制的研究.pdf

1、多囊腎病(polycystickidneydisease，PKD)是指雙側腎臟發(fā)生多個囊腫且進行性長大而導致腎臟結構和功能損害的一種單基因遺傳性疾病。根據遺傳方式的不同多囊腎可以分為兩種:常染色體顯性遺傳性多囊腎病和常染色體隱性遺傳性多囊腎病。在北美大約有500，000受累ADPKD的發(fā)病率為1/500-1000，ARPKD的發(fā)病率為1/40000。B6C3Fea/a-bpck是一種常染色體隱性遺傳性多囊腎(ARPKD)的動物模型。缺失

2、的TMEM67基因與人類的MKS3以及Wistar大鼠多囊腎模型具有同源性。
　　 目的:
　　 在確定此模型作為ARPKD研究的可行性后，構建含目的基因TMEM67全長的載體pFlag-CMV-TMEM67。將其轉染到HEK293細胞中，使TMEM67過表達，檢測HEK293細胞中蛋白的表達，以分析TMEM67在ARPKD中可能參與的信號通路。同時應用基因表達譜芯片篩選與正常小鼠相比，突變體小鼠差異表達的基因，初步探討

3、TMEM67引起的ARPKD的機制。
　　 方法:
　　 1設計引物，取小鼠尾尖，進行PCR，鑒定小鼠基因型后，取不同時期WT（野生型）和MUT（突變體）小鼠腎臟，HE染色，觀察不同時期小鼠腎臟囊性結構的變化，進一步確定此模型作為隱性遺傳性多囊腎研究的可行性。
　　 2應用分子生物學實驗方法構建含TMEM67全長的載體pFlag-CMV-TMEM67。
　　 3培養(yǎng)HEK293細胞，對其轉染空載體和含TM

4、EM67全長的載體，經過不同處理后，應用WesternBlot實驗方法探討TMEM67引起ARPKD參與的信號通路。
　　 4取出生后3天WT和MUT小鼠腎臟組織，應用表達譜芯片技術，篩選出WT和MUT小鼠上調和下調的差異基因。取其中與腎臟發(fā)生發(fā)展有關的基因，用實時定量PCR(RealtimePCR)驗證芯片結果的可靠性。
　　 結果:
　　 1通過對不同時期小鼠腎臟囊性結構的觀察發(fā)現，小鼠最早在懷孕15.5天時

5、開始出現囊性結構，比Jackson實驗室報道的時間要早。隨著時間的增長，小鼠腎臟的囊性結構開始擴大。在解剖懷孕18.5的孕鼠時，發(fā)現有死胎現象，經過基因型鑒定，是MUT小鼠。在出生后18天，小鼠腎臟組織被囊性結構代替，最終因全身衰竭而死。B6C3Fea/a-bpck作為ARPKD的動物模型是可行的。
　　 2應用酶切及凝膠電泳鑒定法，根據酶切片段大小，初步鑒定重組pFlag-CMV-TMEM67質粒序列正確。設計3對引物，對重組

6、質粒進行全基因測序結果顯示，構建的載體pFlag-CMV-TMEM67含有TMEM67全長序列。
　　 3TMEM67的表達產物Meckelin，不是絡氨酸磷酸化蛋白。通過對HEK293細胞中TMEM67的過表達以及不同時期小鼠MUT小鼠腎臟的研究證實TMEM67引起JNK以及ERK的磷酸化水平的增加。TMEM67在ARPKD中是通過EGFR-ERK和JUK信號通路發(fā)揮作用的。而不是通過mTOR信號通路發(fā)揮作用的。
　　

7、 4用MouseGenome4302.0Array芯片篩選出表達差異大于1.5倍的基因，其中表達上調的有138個，表達下調的有115個。
　　 結論:
　　 1B6C3Fea/a-bpck小鼠作為研究ARPKD的動物模型是可行的。
　　 2成功構建的載體pFlag-CMV-TMEM67。
　　 3TMEM67在ARPKD中是通過ERK和JUK信號通路而不是mTOR信號通路發(fā)揮作用的。
　　 4表達