TMEM67在隱性多囊腎發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)分子機(jī)制的研究.pdf

1、多囊腎病(polycystickidneydisease，PKD)是指雙側(cè)腎臟發(fā)生多個(gè)囊腫且進(jìn)行性長(zhǎng)大而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害的一種單基因遺傳性疾病。根據(jù)遺傳方式的不同多囊腎可以分為兩種:常染色體顯性遺傳性多囊腎病和常染色體隱性遺傳性多囊腎病。在北美大約有500，000受累ADPKD的發(fā)病率為1/500-1000，ARPKD的發(fā)病率為1/40000。B6C3Fea/a-bpck是一種常染色體隱性遺傳性多囊腎(ARPKD)的動(dòng)物模型。缺失

2、的TMEM67基因與人類的MKS3以及Wistar大鼠多囊腎模型具有同源性。
　　 目的:
　　 在確定此模型作為ARPKD研究的可行性后，構(gòu)建含目的基因TMEM67全長(zhǎng)的載體pFlag-CMV-TMEM67。將其轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，使TMEM67過表達(dá)，檢測(cè)HEK293細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，以分析TMEM67在ARPKD中可能參與的信號(hào)通路。同時(shí)應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片篩選與正常小鼠相比，突變體小鼠差異表達(dá)的基因，初步探討

3、TMEM67引起的ARPKD的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1設(shè)計(jì)引物，取小鼠尾尖，進(jìn)行PCR，鑒定小鼠基因型后，取不同時(shí)期WT（野生型）和MUT（突變體）小鼠腎臟，HE染色，觀察不同時(shí)期小鼠腎臟囊性結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步確定此模型作為隱性遺傳性多囊腎研究的可行性。
　　 2應(yīng)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建含TMEM67全長(zhǎng)的載體pFlag-CMV-TMEM67。
　　 3培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，對(duì)其轉(zhuǎn)染空載體和含TM

4、EM67全長(zhǎng)的載體，經(jīng)過不同處理后，應(yīng)用WesternBlot實(shí)驗(yàn)方法探討TMEM67引起ARPKD參與的信號(hào)通路。
　　 4取出生后3天WT和MUT小鼠腎臟組織，應(yīng)用表達(dá)譜芯片技術(shù)，篩選出WT和MUT小鼠上調(diào)和下調(diào)的差異基因。取其中與腎臟發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因，用實(shí)時(shí)定量PCR(RealtimePCR)驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)果:
　　 1通過對(duì)不同時(shí)期小鼠腎臟囊性結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠最早在懷孕15.5天時(shí)

5、開始出現(xiàn)囊性結(jié)構(gòu)，比Jackson實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的時(shí)間要早。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，小鼠腎臟的囊性結(jié)構(gòu)開始擴(kuò)大。在解剖懷孕18.5的孕鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)有死胎現(xiàn)象，經(jīng)過基因型鑒定，是MUT小鼠。在出生后18天，小鼠腎臟組織被囊性結(jié)構(gòu)代替，最終因全身衰竭而死。B6C3Fea/a-bpck作為ARPKD的動(dòng)物模型是可行的。
　　 2應(yīng)用酶切及凝膠電泳鑒定法，根據(jù)酶切片段大小，初步鑒定重組pFlag-CMV-TMEM67質(zhì)粒序列正確。設(shè)計(jì)3對(duì)引物，對(duì)重組

6、質(zhì)粒進(jìn)行全基因測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的載體pFlag-CMV-TMEM67含有TMEM67全長(zhǎng)序列。
　　 3TMEM67的表達(dá)產(chǎn)物Meckelin，不是絡(luò)氨酸磷酸化蛋白。通過對(duì)HEK293細(xì)胞中TMEM67的過表達(dá)以及不同時(shí)期小鼠MUT小鼠腎臟的研究證實(shí)TMEM67引起JNK以及ERK的磷酸化水平的增加。TMEM67在ARPKD中是通過EGFR-ERK和JUK信號(hào)通路發(fā)揮作用的。而不是通過mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用的。
　　

7、 4用MouseGenome4302.0Array芯片篩選出表達(dá)差異大于1.5倍的基因，其中表達(dá)上調(diào)的有138個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有115個(gè)。
　　 結(jié)論:
　　 1B6C3Fea/a-bpck小鼠作為研究ARPKD的動(dòng)物模型是可行的。
　　 2成功構(gòu)建的載體pFlag-CMV-TMEM67。
　　 3TMEM67在ARPKD中是通過ERK和JUK信號(hào)通路而不是mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用的。
　　 4表達(dá)