miR-29a在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機制.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種全身性的、彌漫的慢性發(fā)展過程，是導致冠心病的主要病理基礎。大量研究發(fā)現(xiàn)，炎癥和代謝異常與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關，而其中脂質代謝作為冠心病獨立的危險因素在動脈硬化發(fā)生過程中起著至關重要的作用。動脈粥樣硬化的病理過程大概分為血管內皮功能受損、血管內膜增厚和斑塊形成三個階段。其中以血管平滑肌細胞增殖和脂質沉積為主要特征的血管內膜增厚階段是動脈硬化形成的主要環(huán)節(jié)，因此對于這部分的

2、研究一直是熱點問題。
　　 MicroRNA（miRNA）是一種由非編碼區(qū)域轉錄的小片段RNA，廣泛的參與細胞的生長、分化、發(fā)育等生理病理過程。隨著對miRNA認識的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)miRNA在心血管疾病中起到了極其重要的作用，不僅參與心血管疾病的發(fā)生過程，其表達變化還與疾病的診斷和預后密切相關。MicroRNA-29a(miR-29a)是新近發(fā)現(xiàn)的一個與細胞增殖緊密相關的小分子RNA家族，參與多種疾病，如肝纖維化，腫瘤的

3、發(fā)生發(fā)展過程等。本實驗將探討miR-29a在動脈粥樣硬化的發(fā)生、斑塊穩(wěn)定方面的作用及其分子機制。
　　 方法:
　　 1.動脈粥樣硬化動物模型的復制及分組
　　 本實驗動物分為五組，分別為C57BL/6J對照組(B6，n=3)、ApoE敲除小鼠正常飲食組(AD，n=3)、ApoE敲除小鼠高脂飲食組(AG，n=3)、ApoE敲除小鼠尾靜脈注射pAd-GFP病毒高脂飲食組(AP，n=3)、以及ApoE敲除小鼠尾靜脈注

4、射pAd-miR-29a病毒高脂飲食組(AM，n=3)。C57BL/6J及AD組，正常飲食。AG、AP、AM組，高脂飲食。AP組分別于高脂飲食第1、7、14天尾靜脈注射pAd-GFP病毒(1×109pfu)。AM組分別于高脂飲食第1、7、14天尾靜脈注射miR-29a病毒(1×109pfu)
　　 2.miR-29a轉染不影響動脈粥樣硬化小鼠的血脂水平
　　 與B6組和AD組小鼠相比，AG組、AP組和AM組（血脂各項指標

5、比較除HDL以外均有顯著性差異，其中TC和LDL-C升高最為顯著，6周末升高了3到5倍。但三組間比較差異無統(tǒng)計學意義，以上結果提示，血脂增高在AS斑塊形成過程中發(fā)揮了重要的作用，但轉染miR-29a對血脂水平無影響。
　　 3.miR-29a對脂質斑塊形成的影響
　　 高分辨力超聲檢查:高脂飼養(yǎng)6周末B6組、AD組小鼠主動動脈弓內膜光滑完整，連續(xù)，內膜不厚，彩色充盈佳。ApoE敲除小鼠高脂飲食6周后，AG、AP和AM組小

6、鼠主動動脈弓內膜漸粗糙不完整，回聲有間斷，內膜增厚厚，彩色充盈尚可，可見低回聲脂質斑塊。
　　 4.miR-29a轉染促進斑塊組織中平滑肌細胞的增殖
　　 各組小鼠取胸腹主動脈，經HE染色后，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，B6組和AD組小鼠血管內膜光滑，彈力層完整，中膜未變化;AG組、AP組、AM組均見內膜增厚，有較大斑塊形成;AG組和AP組沒有明顯區(qū)別;AM組可見增殖內膜中新增血管平滑肌細胞數(shù)量明顯增多，提示，miR-29a轉染可能

7、通過促進平滑肌細胞的增殖而促進斑塊的形成。
　　 5miR-29a不影響斑塊組織中脂質的沉積
　　 油紅O染色顯示飼喂高脂飼料各組老鼠斑塊的泡沫細胞內含有大量聚集的脂肪呈鮮紅色。AG組、AP組和AM組均可以看到紅染脂質浸潤、斑塊形成及血栓脫落;三組之間無明顯差異。提示，miR-29a轉染不影響斑塊組織的脂質沉積。
　　 6.miR-29a促進斑塊組織中膠原的合成
　　 天狼猩紅（膠原）與油紅O（脂質）復合

8、染色可見，與B6組及AD組相比，AG組、AP組、AM組膠原合成明顯增多，其中以AM組增加最為明顯。上述結果提示miR-29a可以促進斑塊組織內膠原的合成。
　　 7.miR-29a不影響斑塊組織中巨噬細胞的侵潤
　　 我們用免疫組化檢測巨噬細胞標志物F4/80在各組斑塊中的表達與分布，結果發(fā)現(xiàn)，在B6組和AD組血管壁中，偶見F4/80陽性的細胞;而AG組、AP組和AM組中，F(xiàn)4/80陽性細胞數(shù)及單細胞染色強度均較B6組和

9、AD組明顯增高，而且主要分布在中膜層和新生內膜層;AG組、AP組和AM組之間未見顯著差別。提示，動脈斑塊形成伴隨炎性細胞浸潤，而過表達miR-29a并不促進巨噬細胞的聚集和侵潤。
　　 8.miR-29a促進斑塊組織中平滑肌細胞的增殖
　　 免疫組化的方法檢測了各組斑塊內PCNA的表達，結果顯示，B6組和AD組血管壁中偶見PCNA陽性的細胞，AG、AP和AM組PCNA陽性細胞數(shù)及單細胞染色強度均較B6組和AD組增高，且主

10、要分布在新生內膜層，其中以AM組PCNA陽性細胞數(shù)最多，為對照組的5倍，說明，miR-29a可以促進平滑肌細胞的增殖。
　　 9.miR-29a促進斑塊組織中平滑肌細胞KLF5的表達
　　 為了進一步明確miR-29a促進斑塊內平滑肌細胞增殖的分子機制，我們用免疫組化和RT-PCR的方法，檢測了斑塊組織內KLF5表達及其分布，結果發(fā)現(xiàn)，KLF5陽性的細胞在AM組較B6和AD組，增加了近5倍。提示，miR-29a促進了斑塊

11、內血管平滑肌細胞的增殖的分子機制可能與上調增殖相關轉錄因子KLF5的表達有關。
　　 結果:
　　 1.動脈粥樣硬化動物模型的復制及分組。
　　 2.miR-29a轉染不影響動脈粥樣硬化小鼠的血脂水平。
　　 3.miR-29a對脂質斑塊形成的影響。
　　 4.miR-29a轉染促進斑塊組織中平滑肌細胞的增殖。
　　 5.miR-29a不影響斑塊組織中脂質的沉積。
　　 6.miR

12、-29a促進斑塊組織中膠原的合成。
　　 7.miR-29a不影響斑塊組織中巨噬細胞的侵潤。
　　 8.miR-29a促進斑塊組織中平滑肌細胞的增殖。
　　 9.miR-29a促進斑塊組織中平滑肌細胞KLF5的表達。
　　 結論:
　　 1.miR-29a轉染可以促進斑塊內平滑肌細胞的增殖。
　　 2.miR-29a轉染不影響斑塊組織的脂質沉積和巨噬細胞浸潤。
　　 3.miR-2