腎素(前體)受體在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理生理基礎(chǔ)。為了有效地阻止動(dòng)脈粥樣硬化引起的損傷,人們對(duì)其機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了百余年的探究。目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究中,炎癥反應(yīng)學(xué)說占有主要地位,并得到學(xué)界的廣泛認(rèn)同。內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生在動(dòng)脈粥樣硬化早期,在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。內(nèi)皮功能紊亂與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活及相關(guān)的炎癥機(jī)制在以動(dòng)脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)的心血管疾病中起重要作用。
　　 RAS過度激活與多種疾病的發(fā)生

2、發(fā)展密切相關(guān),如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚、細(xì)胞凋亡、心力衰竭及腎功能不全等。在經(jīng)典的RAS中,血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)被認(rèn)為是最主要的損傷效應(yīng)分子,它可以直接使平滑肌收縮,內(nèi)皮素生成增加,并促進(jìn)超氧陰離子的產(chǎn)生滅活NO;通過激活、招募炎癥細(xì)胞到達(dá)受損血管表面,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng);調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)的多種細(xì)胞間粘附分子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子及趨化因子等;還作用于一些核轉(zhuǎn)錄因子,間接調(diào)控炎癥反應(yīng),加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。

3、r>　　 臨床應(yīng)用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物通過減少AngⅡ生成或抑制AngⅡ受體來抑制RAS,這對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到了一定的治療作用。臨床研究結(jié)果顯示似乎對(duì)RAS系統(tǒng)并未達(dá)到完全阻斷,臨床上也未取得令人滿意的抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的治療效果。最新RAS阻斷劑—腎素抑制劑(Aliskiren)的研究發(fā)現(xiàn)其并不能阻斷受體介導(dǎo)的信號(hào)通道的激活以及激活后受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶器官帶來的損害,未能達(dá)

4、到人們所預(yù)期的理想的RAS阻斷效果。
　　 近年人們發(fā)現(xiàn)腎素(前體)受體[renin/prorenin receptor,(P)RR]是腎素和腎素前體共同的功能性受體。腎素和腎素前體與(P)RR活性位點(diǎn)結(jié)合后,分子構(gòu)型發(fā)生了改變,其酶活性增加,直接激活有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。由此發(fā)現(xiàn)了腎素和腎素前體可不依賴于傳統(tǒng)的RAS激活而發(fā)揮生物學(xué)作用。由腎素、腎素前體和(P)RR組成的腎素(前體)受體系統(tǒng)被認(rèn)為是RAS的新成員,成為人們研究的

5、熱點(diǎn)。
　　 本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中有腎素受體存在。腎素(前體)受體系統(tǒng)是否通過引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,進(jìn)而參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,目前尚無相關(guān)報(bào)道。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs),它是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。ERK1/2和p38通路是MAPKs信號(hào)通路中與炎癥關(guān)系較為密切的信號(hào)通路,本實(shí)驗(yàn)以

6、此為研究對(duì)象,探討腎素(前體)激活(P)RR對(duì)相關(guān)炎癥因子及氧化應(yīng)激的影響。
　　 PI3K/AKT信號(hào)通路能直接磷酸化多種細(xì)胞因子,與血管壁細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移和肥大有關(guān)。因而認(rèn)為PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。激活(P)RR是否能夠影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活化,并參與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥因子的表達(dá),尚有待證實(shí)。
　　 人工合成的腎素前體前肽(HRP)是依據(jù)腎素前體前肽合成的10個(gè)氨基

7、酸片段。一直被認(rèn)為(P)RR阻滯劑,可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制腎素前體與(P)RR的結(jié)合。但是目前對(duì)HRP是否能夠阻斷(P)RR相關(guān)研究結(jié)果并不一致。
　　 利用在體外培養(yǎng)的HUVECs中,觀察腎素(前體)激活(P)RR及干擾(P)RR后對(duì)ERK1/2及p38 MAPKs信號(hào)通路蛋白表達(dá)、血管細(xì)胞間粘附分子(VCAM-1)蛋白表達(dá)及超氧化物歧化酶(SOD)濃度的影響,探討其對(duì)HUVECs的影響;同時(shí)觀察在離體培養(yǎng)的HUVEC中,腎素前體能否

8、通過(P)RR不依賴于AngⅡ直接調(diào)節(jié)細(xì)胞中PI3K/AKT,NFκB蛋白以及炎癥因子IL-6的表達(dá),并觀察HRP是否存在(P)RR阻斷功能。從分子機(jī)制探討(P)RR在氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)中作用及機(jī)制,進(jìn)而探討(P)RR與動(dòng)脈粥樣硬化等伴有血管內(nèi)皮損傷性心血管疾病的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)原代HUVECs,應(yīng)用免疫組化檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原及流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34分子進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 2.在HUVE

9、Cs中以siRNA干擾(P)RR,用RT-PCR方法檢測(cè)干擾24,48及72小時(shí)后(P)RR的mRNA表達(dá),確定干擾效率最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　 3.以奧美沙坦和PD123319阻斷Ang-Ⅱ受體AT1、AT2。分別以人重組腎素(renin)及腎素前體(proreniff)處理HUVECs,于處理后5,10,20,35,60,90分鐘收取蛋白,用western blot法檢測(cè)ERK1/2及p38信號(hào)通路蛋白磷酸化程度,確定腎素及其前體

10、刺激致兩信號(hào)通路蛋白磷酸化的最強(qiáng)時(shí)間點(diǎn)。
　　 4.以奧美沙坦和PD123319處理HUVECs30分鐘后,分別以人重組腎素及腎素前體刺激HUVECs,分別用western blot法,ELISA法和比色法觀察腎素及其前體是否可使信號(hào)通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化增強(qiáng)、粘附分子VCAM-1表達(dá)增高、抗氧化酶SOD含量降低,以及干擾(P)RR表達(dá)后是否可阻斷或減弱腎素及其前體的上述作用。
　　 5.以奧美沙坦(10-5

11、M)和PD123319(10-4M)分別阻斷HUVECs血管緊張素Ⅱ受體AT1、AT2,觀察腎素前體(2×10-9M)對(duì)細(xì)胞中PI3K,p-AKT,NFκB-P65蛋白以及細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6的影響。
　　 6.分別以(P)RR-siRNA干擾細(xì)胞(P)RR,以及三種濃度的HRP(1×10-6M,5×10-6M,10×10-6M)作用于細(xì)胞,觀察各自對(duì)腎素前體引起的AKT激活、NFκB-P65和IL-6蛋白表達(dá)的影響。<

12、br>　　 7.以Wortmannin(0.5×10-6M)阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路,觀察wortmannin對(duì)腎素前體引起的AKT激活、NFκB-P65和IL-6蛋白表達(dá)的影響。
　　 8.PI3K,P-AKT,p65蛋白通過western-blot檢測(cè)。
　　 9.細(xì)胞上清液中IL-6的濃度用ELISA試劑盒檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1.CD34流式細(xì)胞鑒定,HUVECs百分率達(dá)98.35％,

13、HUVECs免疫組化檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性。
　　 2.RT-PCR結(jié)果證實(shí)(P)RR的mRNA在HUVECs中有表達(dá),siRNA干擾(P)RR后72小時(shí),(P)RR mRNA在HUVECs中表達(dá)最弱。
　　 3.經(jīng)人重組腎素前體及腎素處理HUVECs后,信號(hào)通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化水平增強(qiáng),在腎素作用于細(xì)胞后20分鐘,ERK及p38磷酸化程度最強(qiáng);分別在腎素前體作用于細(xì)胞后60分鐘及35分鐘,ERK及p38磷

14、酸化最強(qiáng)。
　　 4.人重組腎素及腎素前體刺激HUVECs,可增高信號(hào)通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化水平,上調(diào)粘附分子VCAM-1表達(dá),降低抗氧化酶SOD含量。干擾(P)RR后上述作用明顯受到抑制。
　　 5.腎素前體可以激活PI3K,P-AKT,上調(diào)P65蛋白和炎癥因子IL-6的表達(dá)。
　　 6.(P)RR干擾可以抑制腎素前體引起的AKT激活及P65蛋白和炎癥因子IL-6表達(dá)的上調(diào)。
　　 7.腎素

15、前體引起的P65和IL-6表達(dá)增加不能被wortmannin所抑制。
　　 8.三種HRP濃度均不能抑制腎素前體引起的AKT激活及P65蛋白和炎癥因子IL-15表達(dá)的上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.(P)RR存在于HUVECs中。
　　 2.腎素及其前體通過(P)RR激活ERK1/2及p38 MAPKs信號(hào)通路,抑制SOD表達(dá),上調(diào)炎癥因子VCAM-1蛋白表達(dá),該作用獨(dú)立于AngⅡ。
　　 3.腎