腎素(前體)受體在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用及機制研究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理生理基礎。為了有效地阻止動脈粥樣硬化引起的損傷,人們對其機制已經(jīng)進行了百余年的探究。目前關于動脈粥樣硬化機制研究中,炎癥反應學說占有主要地位,并得到學界的廣泛認同。內皮細胞損傷發(fā)生在動脈粥樣硬化早期,在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中起關鍵作用。內皮功能紊亂與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活及相關的炎癥機制在以動脈粥樣硬化為病理基礎的心血管疾病中起重要作用。
　　 RAS過度激活與多種疾病的發(fā)生

2、發(fā)展密切相關,如高血壓、動脈粥樣硬化、心肌肥厚、細胞凋亡、心力衰竭及腎功能不全等。在經(jīng)典的RAS中,血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)被認為是最主要的損傷效應分子,它可以直接使平滑肌收縮,內皮素生成增加,并促進超氧陰離子的產(chǎn)生滅活NO;通過激活、招募炎癥細胞到達受損血管表面,調節(jié)炎癥反應;調節(jié)參與炎癥反應的多種細胞間粘附分子、細胞生長因子及趨化因子等;還作用于一些核轉錄因子,間接調控炎癥反應,加速動脈粥樣硬化的進程。

3、r>　　 臨床應用的血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物通過減少AngⅡ生成或抑制AngⅡ受體來抑制RAS,這對動脈粥樣硬化起到了一定的治療作用。臨床研究結果顯示似乎對RAS系統(tǒng)并未達到完全阻斷,臨床上也未取得令人滿意的抑制動脈粥樣硬化進展的治療效果。最新RAS阻斷劑—腎素抑制劑(Aliskiren)的研究發(fā)現(xiàn)其并不能阻斷受體介導的信號通道的激活以及激活后受調節(jié)的轉錄因子對靶器官帶來的損害,未能達

4、到人們所預期的理想的RAS阻斷效果。
　　 近年人們發(fā)現(xiàn)腎素(前體)受體[renin/prorenin receptor,(P)RR]是腎素和腎素前體共同的功能性受體。腎素和腎素前體與(P)RR活性位點結合后,分子構型發(fā)生了改變,其酶活性增加,直接激活有關的信號傳導通路。由此發(fā)現(xiàn)了腎素和腎素前體可不依賴于傳統(tǒng)的RAS激活而發(fā)揮生物學作用。由腎素、腎素前體和(P)RR組成的腎素(前體)受體系統(tǒng)被認為是RAS的新成員,成為人們研究的

5、熱點。
　　 本課題組前期實驗證實在人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中有腎素受體存在。腎素(前體)受體系統(tǒng)是否通過引起內皮細胞功能紊亂,進而參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,目前尚無相關報道。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs),它是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。ERK1/2和p38通路是MAPKs信號通路中與炎癥關系較為密切的信號通路,本實驗以

6、此為研究對象,探討腎素(前體)激活(P)RR對相關炎癥因子及氧化應激的影響。
　　 PI3K/AKT信號通路能直接磷酸化多種細胞因子,與血管壁細胞表型轉換、增殖、遷移和肥大有關。因而認為PI3K/AKT信號通路可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。激活(P)RR是否能夠影響PI3K/AKT信號通路的活化,并參與動脈粥樣硬化相關炎癥因子的表達,尚有待證實。
　　 人工合成的腎素前體前肽(HRP)是依據(jù)腎素前體前肽合成的10個氨基

7、酸片段。一直被認為(P)RR阻滯劑,可以競爭性抑制腎素前體與(P)RR的結合。但是目前對HRP是否能夠阻斷(P)RR相關研究結果并不一致。
　　 利用在體外培養(yǎng)的HUVECs中,觀察腎素(前體)激活(P)RR及干擾(P)RR后對ERK1/2及p38 MAPKs信號通路蛋白表達、血管細胞間粘附分子(VCAM-1)蛋白表達及超氧化物歧化酶(SOD)濃度的影響,探討其對HUVECs的影響;同時觀察在離體培養(yǎng)的HUVEC中,腎素前體能否

8、通過(P)RR不依賴于AngⅡ直接調節(jié)細胞中PI3K/AKT,NFκB蛋白以及炎癥因子IL-6的表達,并觀察HRP是否存在(P)RR阻斷功能。從分子機制探討(P)RR在氧化應激及炎癥反應中作用及機制,進而探討(P)RR與動脈粥樣硬化等伴有血管內皮損傷性心血管疾病的關系。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)原代HUVECs,應用免疫組化檢測Ⅷ因子相關抗原及流式細胞儀檢測CD34分子進行細胞鑒定。
　　 2.在HUVE

9、Cs中以siRNA干擾(P)RR,用RT-PCR方法檢測干擾24,48及72小時后(P)RR的mRNA表達,確定干擾效率最佳時間點。
　　 3.以奧美沙坦和PD123319阻斷Ang-Ⅱ受體AT1、AT2。分別以人重組腎素(renin)及腎素前體(proreniff)處理HUVECs,于處理后5,10,20,35,60,90分鐘收取蛋白,用western blot法檢測ERK1/2及p38信號通路蛋白磷酸化程度,確定腎素及其前體

10、刺激致兩信號通路蛋白磷酸化的最強時間點。
　　 4.以奧美沙坦和PD123319處理HUVECs30分鐘后,分別以人重組腎素及腎素前體刺激HUVECs,分別用western blot法,ELISA法和比色法觀察腎素及其前體是否可使信號通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化增強、粘附分子VCAM-1表達增高、抗氧化酶SOD含量降低,以及干擾(P)RR表達后是否可阻斷或減弱腎素及其前體的上述作用。
　　 5.以奧美沙坦(10-5

11、M)和PD123319(10-4M)分別阻斷HUVECs血管緊張素Ⅱ受體AT1、AT2,觀察腎素前體(2×10-9M)對細胞中PI3K,p-AKT,NFκB-P65蛋白以及細胞上清液中炎癥因子IL-6的影響。
　　 6.分別以(P)RR-siRNA干擾細胞(P)RR,以及三種濃度的HRP(1×10-6M,5×10-6M,10×10-6M)作用于細胞,觀察各自對腎素前體引起的AKT激活、NFκB-P65和IL-6蛋白表達的影響。<

12、br>　　 7.以Wortmannin(0.5×10-6M)阻斷PI3K/AKT信號通路,觀察wortmannin對腎素前體引起的AKT激活、NFκB-P65和IL-6蛋白表達的影響。
　　 8.PI3K,P-AKT,p65蛋白通過western-blot檢測。
　　 9.細胞上清液中IL-6的濃度用ELISA試劑盒檢測。
　　 結果:
　　 1.CD34流式細胞鑒定,HUVECs百分率達98.35％,

13、HUVECs免疫組化檢測Ⅷ因子相關抗原陽性。
　　 2.RT-PCR結果證實(P)RR的mRNA在HUVECs中有表達,siRNA干擾(P)RR后72小時,(P)RR mRNA在HUVECs中表達最弱。
　　 3.經(jīng)人重組腎素前體及腎素處理HUVECs后,信號通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化水平增強,在腎素作用于細胞后20分鐘,ERK及p38磷酸化程度最強;分別在腎素前體作用于細胞后60分鐘及35分鐘,ERK及p38磷

14、酸化最強。
　　 4.人重組腎素及腎素前體刺激HUVECs,可增高信號通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化水平,上調粘附分子VCAM-1表達,降低抗氧化酶SOD含量。干擾(P)RR后上述作用明顯受到抑制。
　　 5.腎素前體可以激活PI3K,P-AKT,上調P65蛋白和炎癥因子IL-6的表達。
　　 6.(P)RR干擾可以抑制腎素前體引起的AKT激活及P65蛋白和炎癥因子IL-6表達的上調。
　　 7.腎素

15、前體引起的P65和IL-6表達增加不能被wortmannin所抑制。
　　 8.三種HRP濃度均不能抑制腎素前體引起的AKT激活及P65蛋白和炎癥因子IL-15表達的上調。
　　 結論:
　　 1.(P)RR存在于HUVECs中。
　　 2.腎素及其前體通過(P)RR激活ERK1/2及p38 MAPKs信號通路,抑制SOD表達,上調炎癥因子VCAM-1蛋白表達,該作用獨立于AngⅡ。
　　 3.腎