FIZZ1在動脈粥樣硬化進展中的作用及其機制.pdf

1、研究背景 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)病機制的研究已經經歷了一個多世紀，主要圍繞4種學說：脂肪浸潤學說、血小板聚集和血栓形成學說、平滑肌細胞克隆學說和損傷反應學說，但至今詳細發(fā)病機理仍未完全闡明。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化的病理表現(xiàn)具有炎癥病理的基本表現(xiàn)形式：變質、滲出和增生，其形成過程中也會出現(xiàn)類似類風濕性關節(jié)炎、慢性胰腺炎和肝硬化等慢性炎癥性疾病的細胞間相互作用，隨著炎癥細胞和炎癥介質的不斷檢

2、出，動脈粥樣硬化不再被認為是單純的動脈壁脂質堆積的疾病，而是進展性炎癥反應，符合炎癥表現(xiàn)的普遍規(guī)律。目前，在動脈粥樣硬化發(fā)現(xiàn)的促炎因子較多，如血小板源性生長因子β(PDGF-β)、血小板衍生因子(PDEF)、單核細胞趨化蛋白1、白細胞介素3、環(huán)氧合酶-2、基質金屬蛋白酶、去組合蛋白、脂肪酸結合蛋白等，由于目前臨床針對上述介質的抗動脈粥樣硬化藥物起效緩慢且療效有待提高，因此是否還有其它炎癥因子參與動脈粥樣硬化進展有待進一步研究。FIZZ1

3、(Found in Inflammatory Zone 1)是2000年新發(fā)現(xiàn)的一個與炎癥相關的缺氧誘導有絲分裂因子，是運用表達序列標記數(shù)據(jù)庫掃描的方法發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，分子量9.4KD，具有刺激肺動脈平滑肌細胞增殖、收縮血管、促進血管新生、刺激肌纖維母細胞分化等功能，在脂肪組織的間質血管以及選擇性激活的巨噬細胞中均有表達，缺氧的肺血管壁也有表達，在實驗性肺纖維化、哮喘、過敏性肺炎、寄生蟲感染等疾病中具有重要意義，其在動脈粥樣硬化中

4、是否表達則為未知，由于動脈粥樣硬化斑塊內存在Th2型細胞因子以及大量激活的巨噬細胞，動脈粥樣硬化的血管壁也存在缺氧，因此，我們推測在動脈粥樣硬化斑塊內可能有FIZZ1表達。本實驗用免疫組織化學方法檢測動脈粥樣硬化斑塊內FIZZ1表達，RT-PCR檢測FIZZ1mRNA表達，并探討FIZZ1對體外培養(yǎng)的平滑肌細胞增殖，平滑肌細胞清道夫受體SR-A，巨噬細胞CD36表達影響，同時探討降脂治療對動脈粥樣硬化斑塊FIZZ1表達的影響。

5、研究方法 本研究分三部分，第一部分：選取C57BL/6J ApoE基因敲除鼠及C57BL/6J野生型小鼠，分別喂食高脂飼料及普通飼料，24周后處死小鼠，石蠟包埋血管后作連續(xù)切片，行HE染色及FIZZ1免疫組化染色，檢測斑塊FIZZ1表達情況，RT-PCR檢測動脈粥樣硬化斑塊內FIZZ1mRNA表達，然后，模擬粥樣斑塊內細胞因子環(huán)境，用Th2型細胞因子刺激培養(yǎng)的平滑肌細胞以及巨噬細胞，RT-PCR以及激光共聚焦顯微鏡觀察刺激后細胞

6、FIZZ1mRNA及其蛋白表達情況，初步鑒定粥樣斑塊內分泌FIZZ1的可能的細胞；第二部分用終濃度分別為3×10<'-6>mmol/L，9×10<'-6>mmol/L，2.7×10<'-5>mmol/L的FIZZ1刺激培養(yǎng)的平滑肌細胞，<'3>H摻入法以及MTT法測定FIZZ1對平滑肌細胞增殖的影響；用ox-LDL以及終濃度分別為3×10<'-6>mmol/L，9×10<'-6>mmol/L，2.7×10<'-5>mmol/L的FIZZ

7、1刺激培養(yǎng)的平滑肌細胞，蛋白質印跡技術確認SR-A表達后，激光共聚焦顯微鏡對SR-A表達進行定位，用流式細胞術檢測FIZZ1對平滑肌細胞SR-A及其巨噬細胞CD36表達的影響，評價FIZZ1能否影響動脈粥樣硬化吞噬脂質的關鍵受體。第三部分：制作動脈粥樣硬化以及高脂血癥動物模型，然后用辛伐他汀干預實驗動物，21周后，用免疫組化方法檢測粥樣斑塊FIZZ1蛋白表達情況，RT-PCR方法檢測FIZZ1mRNA表達情況，同時檢測動脈粥樣硬化斑塊形

8、態(tài)及其血脂水平，探討調脂治療對FIZZ1表達的影響。 結果 1．ApoE基因敲除鼠高脂飼養(yǎng)24周后，主動脈根部明顯形成動脈粥樣硬化，斑塊體積大，免疫組化可見FIZZ1在動脈粥樣硬化斑塊內明顯表達，RT-PCR可見FIZZ1mRNA表達，同齡野生型C57BL/6J鼠正常血管壁內，未見FIZZ1表達，Th2型細胞因子能刺激培養(yǎng)的巨噬細胞表達FIZZ1，但不能刺激體外培養(yǎng)的平滑肌細胞表達FIZZ1。 2．MTT檢測平滑

9、肌細胞增殖提示，F(xiàn)IZZ1 3×10<'-6>mmol/L組與對照組吸光度值比較，明顯升高，P<0.05，差異有顯著性；FIZZ1 9×10<'-6>mmol/L，組與FIZZ1 3×10<'-6>mmol/L組比較，吸光度值明顯升高，差異有顯著性，P<0.05，F(xiàn)IZZ1 2.7×10<'-5>mmol/L組與9×10<'-6>mmol/L組比較，吸光度值明顯升高，差異有顯著性，說明FIZZ1能刺激平滑肌細胞增殖。<'3>H-TdR摻

10、入法檢測也提示：FIZZ1刺激平滑肌細胞增殖。 3．激光共聚焦顯微鏡可見在ox-LDL刺激24小時的平滑肌細胞，有SR-A表達，主要位于細胞膜，蛋白質印跡技術發(fā)現(xiàn)ox-LDL能促進平滑肌細胞SR-A表達。 4．流式細胞術檢測提示，F(xiàn)IZZ1 3×10<'-6>mmol/L組與對照組SR-A表達陽性率比較，統(tǒng)計學上有極顯著性差異(P<0.01)；FIZZ1 9×10<'-6>mmol/L組與FIZZ1 3×10<'-6>m

11、mol/L組SR-A表達陽性率比較，有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)IZZ1 2.7×10<'-5>mmol/L組與9×10<'-6>mmol/L組SR-A表達陽性率比較，有極顯著性差異(P<0.01)，說明FIZZ1能明顯促進ox-LDL刺激的平滑肌細胞SR-A表達。 5．ox-LDL明顯刺激巨噬細胞CD36表達，F(xiàn)IZZ1不影響體外培養(yǎng)的巨噬細胞清道夫受體CD36的表達，說明FIZZ1不能通過影響巨噬細胞CD36表達來影響

12、巨噬細胞ox0-LDL的攝取，影響動脈粥樣硬化。 6．Apoe基因敲除鼠高脂飼養(yǎng)21周后，主動脈根部明顯形成動脈粥樣硬化，血脂代謝明顯紊亂，免疫組化可見FIZZ1在粥樣硬化斑塊內明顯表達，辛伐他汀能降低動脈粥樣硬化斑塊內FIZZ1mRNA及其蛋白表達(與對照組比較，差別具有統(tǒng)計學意義，P<0.05)。 結論 1．FIZZ1在ApoE基因敲除鼠粥樣斑塊內明顯表達，同齡野生型C57BL/6J鼠血管壁內，F(xiàn)IZZ1不表

13、達，F(xiàn)IZZ1可能為一種新的影響動脈粥樣硬化進展的促炎因子。 2．Th2型細胞因子可以刺激巨噬細胞FIZZ1表達，但不能刺激平滑肌細胞FIZZ1表達，Th2型細胞因子刺激巨噬細胞可能為斑塊內FIZZ1表達機理之一。 3．FIZZ1明顯刺激體外培養(yǎng)的主動脈平滑肌細胞增殖。 4．FIZZ1不影響體外培養(yǎng)的巨噬細胞清道夫受體CD36的表達，F(xiàn)IZZ1能促進ox-LDL誘導的體外培養(yǎng)的平滑肌細胞SR-A表達，從而可能加速