Nampt在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是腦梗，冠心病，外周血管病等多種心血管疾病的主要誘因。隨著生活水平的不斷提高，AS的發(fā)病率也在迅猛增加。AS病變基礎(chǔ)是脂質(zhì)代謝障礙，斑塊是由病變的血管細(xì)胞和凋亡細(xì)胞累積形成，斑塊一旦破裂會造成血管栓塞進(jìn)而引發(fā)腦卒中，危及人的生命健康。AS的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此臨床上并沒有特異性好且有效的動脈粥樣硬化治療藥物。
　　煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphor

2、ibosyltransferase，NAMPT）是一種由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外都具有活性。Nampt是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成的限速酶，可將底物煙酰胺（NAM）轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物煙酰胺單核苷酸(NMN)，NMN在催化條件下，生成NAD。NAD稱作為輔酶Ⅰ，是參與線粒體呼吸鏈氧化還原反應(yīng)所必需的輔酶。NAD的生物學(xué)功能極其重要，可能能夠直接決定著細(xì)胞的命運(yùn)。
　　本課題組前期基本證實(shí)了Nampt在腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)

3、保護(hù)作用。動脈粥樣硬化被認(rèn)為是腦卒中的發(fā)病因素，但Nampt在AS中確切的作用尚未被證實(shí)。因此，我們采用體外補(bǔ)充Nampt酶產(chǎn)物NMN以及Nampt轉(zhuǎn)基因小鼠與ApoE-/-雜交的ApoE-/-;NamptTg鼠來研究Nampt對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響，初步確定了Nampt可促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本課題進(jìn)一步研究了抑制TNF-α對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響，初步探討了Nampt發(fā)揮作用的機(jī)制，從而為動脈粥樣硬化的治療提供了新靶

4、點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.將8只8周齡左右的ApoE-/-雄性小鼠分為兩組，對照組和實(shí)驗(yàn)組各4只，同時西方高脂飼料喂養(yǎng)，兩個月后，實(shí)驗(yàn)組NMN飲水給藥，給藥劑量為300 mg/kg/天，對照組則繼續(xù)普通飲水。觀察NMN給藥即體外補(bǔ)充Nampt酶產(chǎn)物NMN對AS小鼠主動脈上脂質(zhì)沉積的影響。此外，采用油紅O染色，HE染色，觀察體外補(bǔ)充Nampt酶產(chǎn)物NMN，對AS小鼠斑塊厚度及尺寸的影響，F(xiàn)4/80免疫組化染色觀察主動脈根部

5、斑塊的巨噬細(xì)胞浸潤情況，TNF-α免疫組化染色確定體外補(bǔ)充NMN對主動脈根部斑塊的炎癥因子表達(dá)情況的影響。
　　2.將Nampt轉(zhuǎn)基因鼠與世界上公認(rèn)的動脈粥樣硬化模型鼠ApoE-/-進(jìn)行雜交，獲得ApoE-/-;NamptTg鼠，作為實(shí)驗(yàn)組，以ApoE-/-小鼠作為對照組，西方高脂飼料喂養(yǎng)4個月。對小鼠進(jìn)行主動脈油紅O染色，觀察Nampt轉(zhuǎn)基因?qū)S斑塊的影響。采用油紅O染色，HE染色，觀察Nampt轉(zhuǎn)基因?qū)用}粥樣硬化斑塊的厚度

6、和尺寸的影響;F4/80免疫組化檢測巨噬細(xì)胞浸潤情況，觀察Nampt轉(zhuǎn)基因?qū)用}粥樣硬化斑塊巨噬細(xì)胞浸潤的影響;Masson染色，天狼星紅染色，觀察Nampt轉(zhuǎn)基因?qū)S小鼠斑塊纖維帽和膠原情況的影響;TNF-α，IL-1β免疫組化染色，觀察Nampt轉(zhuǎn)基因?qū)S小鼠斑塊炎癥因子表達(dá)水平的影響;ICAM-1，VCAM-1免疫組化染色，觀察Nampt轉(zhuǎn)基因?qū)S小鼠斑塊中粘附及趨化因子的表達(dá)水平的影響;TUNEL實(shí)驗(yàn)，觀察Nampt轉(zhuǎn)基因

7、對AS斑塊中細(xì)胞凋亡數(shù)目的影響;此外，還進(jìn)行了CD47免疫組化染色，初步探索了參與AS發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　3.將6只ApoE-/-8周齡左右雄性小鼠，分為兩組，對照組和實(shí)驗(yàn)組各3只，6只ApoE-/-;NamptTg8周齡左右雄性鼠，分為兩組，對照組和實(shí)驗(yàn)組各3只。同時西方高脂飲食4個月。實(shí)驗(yàn)組采用腹腔注射TNF-α抗體，劑量為5 mg/kg/天，給藥一個月，隨后進(jìn)行了主動脈根部切片油紅O染色，F(xiàn)4/80免疫組化染色，CD4

8、7免疫組化染色，α-SMA免疫組化染色，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測，進(jìn)一步探索了Nampt對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展影響的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.NMN飲水給藥組與對照組（正常飲水）相比NMN給藥組主動脈上脂質(zhì)沉積較多，斑塊面積和厚度較大，巨噬細(xì)胞浸潤程度較高，炎癥(TNF-α)表達(dá)水平升高。NMN促進(jìn)了AS斑塊增多和炎癥浸潤。
　　2.ApoE-/-和ApoE-/-;NamptTg的主動脈油紅O染色結(jié)果可以看出，

9、相較于ApoE-/-組，ApoE-/-;NamptTg組的主動脈脂質(zhì)沉積較多。Nampt轉(zhuǎn)基因會使得斑塊面積和厚度變大，巨噬細(xì)胞(F4/80)浸潤程度加重，壞死中心擴(kuò)大，Ⅲ型膠原增多，并且炎癥因子(TNF-α，IL-1β)表達(dá)水平升高，粘附和趨化因子（ICAM-1，VCAM-1）表達(dá)水平升高，斑塊中細(xì)胞凋亡數(shù)量增多。
　　3.Nampt轉(zhuǎn)基因小鼠AS進(jìn)程加快的同時也伴隨著CD47表達(dá)水平的上調(diào)。抑制TNF-α不會對ApoE-/-和

10、ApoE-/-;NamptTg AS小鼠的血脂和斑塊面積產(chǎn)生影響，但F4/80和α-SMA的表達(dá)水平下降，即斑塊炎癥和纖維化得到了改善，此外，抑制TNF-α，CD47的表達(dá)水平也隨之下調(diào)，斑塊細(xì)胞凋亡也得到了抑制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.通過體外補(bǔ)充Nampt的酶產(chǎn)物NMN，可促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展，體現(xiàn)為斑塊面積的顯著增加和炎癥的增強(qiáng)。
　　2.和野生型小鼠相比較，在Nampt轉(zhuǎn)基因小鼠上使用高脂飲食誘導(dǎo)的AS發(fā)生發(fā)展