連接粘附分子樣蛋白JAML在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中的作用.pdf

1、目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不完全清楚。越來越多的研究認(rèn)為AS是一種血管受損后發(fā)生的免疫炎癥過程。連接粘附分子樣蛋白(Junction adhesion molecule-like protein，JAML，Amical)是新近發(fā)現(xiàn)的連接粘附分子(Junctional adhesion molecules，JAMs)家族成員，屬于

2、分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白。現(xiàn)有研究表明，JAML主要分布于中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和多種T細(xì)胞等免疫細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的粘附和跨內(nèi)皮遷移、γδT細(xì)胞釋放炎癥因子和生長(zhǎng)因子，在免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。但是，JAML是否參與了AS這種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展的病理過程，是否對(duì)AS斑塊中的炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞功能具有調(diào)控作用，至今尚未見報(bào)道。因此，本課題從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面探討JAML在AS發(fā)生和發(fā)展以及對(duì)巨噬細(xì)胞功能

3、的調(diào)節(jié)作用，從而為防治AS提供新的藥物治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JAML在AS斑塊中的表達(dá)及變化實(shí)驗(yàn)采用冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的有明顯狹窄和有少量斑塊的冠狀動(dòng)脈，用免疫組織化學(xué)法觀察JAML的分布情況和表達(dá)變化;免疫熒光雙標(biāo)法和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)JAML在斑塊內(nèi)的表達(dá)和具體細(xì)胞定位。采用ApoE基因敲除(Apolipoprotein Egene knockout，ApoE-/-)合并高脂飲食制備的AS

4、模型小鼠及其遺傳背景C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)JAML在AS斑塊組織內(nèi)表達(dá)水平的變化。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討JAML在AS發(fā)生和發(fā)展過程中的作用及對(duì)斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)和NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)利用ApoE-/-小鼠分別制備早期AS斑塊模型和晚期AS易損斑塊模型，兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型均采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)染目的基因JAML shRNA或轉(zhuǎn)染對(duì)照shRNA。每組動(dòng)物采用酶法檢測(cè)血清中總膽固醇(Total

5、cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)水平;利用大體油紅O染色測(cè)定主動(dòng)脈的斑塊面積;冰凍切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色、油紅O染色、免疫組織化學(xué)染色、天狼猩紅染色分別檢測(cè)斑塊面積、脂質(zhì)含量、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞以及膠

6、原含量，并最終計(jì)算斑塊的易損指數(shù);免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)斑塊組織中炎癥因子白介素(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumer necrosis factor-α，TNFα)的表達(dá)水平;蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)磷酸化p65表達(dá)水平觀察核因子κB(Neuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路的活化情況。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證JAML在oxLDL活化的單核/巨噬細(xì)胞中的作用及對(duì)NF-κB信號(hào)通路

7、的調(diào)控選取可以代表斑塊內(nèi)主要細(xì)胞成分的原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人外周血單核細(xì)胞、小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7和平滑肌細(xì)胞株，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)了JAML基因的表達(dá)水平;小鼠單核/巨噬細(xì)胞株RAW264.7給予不同濃度或不同時(shí)間點(diǎn)的氧化型低密度脂蛋白(Oxidized-low density lipoprotein，oxLDL)、脂多糖(Lipopoly

8、saccharide，LPS)、TNFα不同刺激物刺激，蛋白免疫印跡法檢測(cè)JAML的表達(dá)變化;采用小干擾RNA脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默巨噬細(xì)胞中JAML的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein1，MCP-1)、IL-10 mRNA水平的變化，并且用蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)磷酸化p65的表達(dá)觀察NF-κ

9、B信號(hào)通路的活化情況。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，與有少量斑塊的冠狀動(dòng)脈相比，具有明顯狹窄的AS患者的斑塊組織內(nèi)JAML的表達(dá)量明顯升高;免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示JAML在斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞中表達(dá)較為豐富，在斑塊內(nèi)其他兩種主要細(xì)胞成分-內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中也有少量表達(dá)。同樣的結(jié)果也在小鼠AS模型中得到了進(jìn)一步的證實(shí)，與正常C57BL/6小鼠相比，ApoE-/-AS模型小鼠主動(dòng)脈中JAML的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2.動(dòng)

10、物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，早期和晚期兩種AS斑塊模型均表現(xiàn)為JAML基因沉默與對(duì)照組相比，體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)血清學(xué)檢測(cè)顯示小鼠TC、TG、LDL和HDL水平也無顯著性差異;主動(dòng)脈大體油紅O染色顯示JAML基因沉默可以明顯減少早期AS斑塊的形成;各種病理學(xué)和免疫組織化學(xué)染色顯示干擾JAML表達(dá)可以減少早期和晚期斑塊內(nèi)的脂質(zhì)含量和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，增加平滑肌細(xì)胞以及膠原含量，最終降低斑塊的易損指數(shù)，穩(wěn)定斑塊;免疫組織化學(xué)染色顯示JAML基因缺陷可以

11、明顯減輕斑塊組織中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)和NF-κB信號(hào)通路的激活。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了JAML在斑塊組織內(nèi)的細(xì)胞定位;用oxLDL或TNF-α刺激巨噬細(xì)胞，JAML蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性的升高，但LPS對(duì)JAML的表達(dá)量無明顯影響。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)巨噬細(xì)胞JAML的表達(dá)水平，可明顯降低oxLDL刺激所導(dǎo)致的IL-6、TNF-α的mRNA水平的升高，但是對(duì)IL-1β、MCP-1、IL-10

12、的mRNA水平的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;另外，干擾JAML蛋白表達(dá)也可以抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。
　　結(jié)論:
　　1.首次檢測(cè)了JAML在AS斑塊中的表達(dá)和細(xì)胞定位。證實(shí)了JAML在AS斑塊中表達(dá)升高，且主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中也有少量表達(dá)，提示JAML有可能參與了AS斑塊內(nèi)多種細(xì)胞成分的功能調(diào)節(jié)。
　　2.首次證明了JAML促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展過程，因此，下調(diào)JAML的表達(dá)可以抑制AS斑塊的形成

13、，減輕斑塊中的炎癥反應(yīng)，增加晚期AS斑塊的穩(wěn)定性。
　　3.初步探討了JAML促進(jìn)AS發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，驗(yàn)證了JAML可以加重AS斑塊中巨噬細(xì)胞的功能紊亂，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子增多及NF-κB信號(hào)通路的活化。
　　綜上所述，本課題一方面將為防治AS提供新的藥物治療靶點(diǎn)，揭示針對(duì)JAML的靶向治療有可能成為臨床防治AS特別是抗炎治療的新的治療策略;另一方面，JAML作為一種分泌性蛋白將有可能作為AS斑塊早期診斷和晚期穩(wěn)定性