動(dòng)脈粥樣硬化中血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)與基因干預(yù)研究.pdf

1、文章分為兩部分進(jìn)行闡述
　　第一部分 人活體動(dòng)脈組織中血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化的研究
　　目的：
　　為了進(jìn)一步明確VCAM-1與CAD的關(guān)系，本研究選擇行主動(dòng)脈-冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass graft，CABG）時(shí)廢棄的主動(dòng)脈管壁組織，應(yīng)用免疫組化檢測VCAM-1表達(dá)，探討人體動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)與AS發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。
　　方法：
　　1.研究對象

2、
　　(1)對象:選取2008年12月至2012年2月在山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院行CABG患者36例，其中男性27例，女性9例，年齡為48～78歲，平均63.6±9.2歲。36例CABG患者中合并吸煙者6例，高血壓15例，糖尿病12例。對照組為12例腎臟移植手術(shù)供體者，均為男性，年齡為34～52歲，平均39.4±4.5歲。入院后經(jīng)查體排除各種明顯器質(zhì)性疾病。
　　(2)標(biāo)本:研究組患者行CABG時(shí)留取廢棄的全層主動(dòng)脈組織，36

3、例CABG取得動(dòng)脈組織56塊。對照組供體者行腎臟移植手術(shù)時(shí)留取廢棄的腎動(dòng)脈組織，12例腎臟移植取得動(dòng)脈組織46塊。
　　2.生化分析
　　所有研究組患者及對照組成員均于清晨空腹采靜脈血6ml，于山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室測定靜脈血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇（high

4、 density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、血清甘油三酯(triglycerides，TG)及脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]、載脂蛋白A(apolipoprotein, ApoA)、脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、間接膽紅素(indirect

5、 bilirubin，IBIL)等生化指標(biāo)。
　　3.冠狀動(dòng)脈造影及冠狀動(dòng)脈Gensini積分測定
　　所有研究組患者均行冠狀動(dòng)脈造影（coronary angiography，CAG），對造影結(jié)果進(jìn)行錄像并刻錄光盤，由兩位介入心血管病專家分析圖像。通過目測法判定冠狀動(dòng)脈狹窄程度。應(yīng)用冠狀動(dòng)脈Gensini積分方法評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度。
　　4.標(biāo)本采集及免疫組化
　　研究組36例患者行CABG手術(shù)時(shí)留取其打

6、孔廢棄的主動(dòng)脈壁全層組織，對照組為12例腎移植供體者移植時(shí)修剪廢棄的動(dòng)脈組織。上述組織獲取后，立即儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)備用。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測定數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，計(jì)量資料均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn)，兩變量之間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.研究組及對照組一般情況比較
　　研究組患者36例均

7、行CABG，其中男性27例，女性9例，年齡為46～78歲，平均63.6±9.2歲。36例CABG患者中合并吸煙者6例，高血壓15例，糖尿病12例。對照組為12例腎臟移植手術(shù)供體者，均為男性，年齡為34～52歲，平均39.4±4.5歲。入院后經(jīng)查體排除各種明顯器質(zhì)性疾病。
　　2.生化指標(biāo):
　　研究組36例患者血漿TC、LDL-C及Lp(a)、ApoB、TG測定值較正常參考值顯著升高，P＜0.05;血漿HDL-C及ApoA測

8、定值與正常參考值相比明顯降低，P＜0.01;研究組患者血漿TBIL及IBIL測定值較正常參考值顯著降低，P＜0.05;血漿DBIL測定值雖然較正常參考值降低，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。
　　2.CAG
　　研究組36例患者行CAG結(jié)果顯示冠狀動(dòng)脈均有不同程度的鈣化、狹窄和迂曲，其中LM病變14例，三支病變14例，二支病變合并LAD近端病變8例;合并慢性閉塞病變4例。研究組36例患者冠狀動(dòng)脈Gensini積分為24

9、～128，平均66.64±29.11。
　　3.動(dòng)脈組織中VCAM-1表達(dá)情況
　　研究組36例患者主動(dòng)脈組織免疫組化檢測均有不同程度的VCAM-1表達(dá)，主動(dòng)脈組織VCAM-1表達(dá)量為0.14～0.40OD，平均0.21±0.05OD。VCAM-1陽性表達(dá)著色主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞漿，表現(xiàn)為棕褐色，染色分布不均勻，呈顆粒狀、片狀、簇狀或條狀。對照組12例動(dòng)脈組織常規(guī)病理組織學(xué)檢查無異常，免疫組化檢測動(dòng)脈組織VCA

10、M-1表達(dá)量為0.06～0.10 OD，平均0.08±0.03OD，研究組和對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1.本研究顯示，研究組36例CAGB患者主動(dòng)脈組織免疫組化檢測VCAM-1表達(dá)量平均為0.21±0.05OD，而對照組12例腎移植廢棄的動(dòng)脈組織免疫組化檢測VCAM-1表達(dá)量平均為0.08±0.03OD，研究組VCAM-1表達(dá)量較對照組明顯增高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

11、　　2.研究組36例CABG患者冠狀動(dòng)脈造影顯示，其Gensini積分平均為66.64±29.11，與主動(dòng)脈組織免疫組化檢測VCAM-1的表達(dá)量呈正相關(guān)。
　　3.CABG患者主動(dòng)脈組織中VCAM-1表達(dá)水平與血漿TG、TC、LDL-C、LP(a)、ApoB呈正相關(guān)，與血漿HDL-C、ApoA呈負(fù)相關(guān)。
　　4.本研究組患者有吸煙、高血壓、糖尿病等病史，較沒有吸煙、高血壓、糖尿病等病史的患者，其主動(dòng)脈組織中VCAM-1表達(dá)量

12、顯著增高。
　　第二部分 血管細(xì)胞粘附分子-1基因沉默對動(dòng)脈硬化斑塊的影響及作用機(jī)制的研究
　　目的:
　　本研究利用載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除小鼠（ApoE-/-小鼠）構(gòu)建AS模型，并通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默，觀察VCAM-1在AS進(jìn)展中所起的作用，為AS的治療提供思路。
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型制備
　　共30

13、支雄性8周齡ApoE-/-小鼠，體重20g～25g，給予高脂飼料飼養(yǎng)。4周后，小鼠被隨機(jī)分為對照組和基因干預(yù)組，每組15只。對照組小鼠經(jīng)股靜脈注射空載體慢病毒懸液(1×108 TU/ml，20ul)，基因干預(yù)組小鼠經(jīng)股靜脈注射VCAM-1干擾慢病毒懸液(1×108 TU/ml，20ul)。
　　2.血脂測定
　　ApoE-/-小鼠麻醉后固定于鼠板上，剪開胸腔，經(jīng)右心房采取靜脈血1.5ml，離心分離血清，應(yīng)用生化自動(dòng)分析儀測定

14、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血清甘油三酯(triglycerides，TG)水平。
　　3.Western Blot
　　利用Western Blot方法檢測對照組及基因沉默組小鼠主動(dòng)

15、脈組織VCAM-1蛋白表達(dá)水平。
　　4.組織學(xué)分析
　　小鼠主動(dòng)脈根部組織經(jīng)OCT包埋機(jī)包埋后切片。組織切片分別進(jìn)行HE染色、油紅O染色及巨噬細(xì)胞MOMA-2染色。
　　5.數(shù)據(jù)分析
　　利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)值變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）來表示，計(jì)量資料之間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒的安全性

16、>　　經(jīng)股靜脈向ApoE-/-小鼠體內(nèi)注射慢病毒懸液或空載體慢病毒懸液后，觀察小鼠進(jìn)食、飲水狀況，未發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象，兩組小鼠均未發(fā)生死亡。試驗(yàn)結(jié)束前稱重，兩組小鼠間體重并未見明顯差異(P＞0.05)。
　　2.ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織的VCAM-1蛋白表達(dá)水平
　　Westem Blot檢測ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中VCAM-1蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示與對照組小鼠相比，基因沉默組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中VCAM-1蛋

17、白水平明顯下降（P＜0.05）。
　　3.VCAM-1基因沉默對ApoE-/-小鼠血脂的影響
　　處死前取靜脈血檢測兩組ApoE-/-小鼠血液中的TC、LDL-C、HDL-C及TG水平，結(jié)果表明兩組小鼠間TC、LDL-C、HDL-C及TG水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可以安全而有效地使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默。
　　2.VCAM-1基