胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用和機制.pdf

1、第一部分胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素體外誘導樹突狀細胞對效應T細胞分化功能的影響及機制
　　目的:研究體外氧化型低密度脂蛋白誘導的胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)對效應T細胞分化功能的影響和機制。
　　方法:培養(yǎng)血管人平滑肌細胞(HVSMC),經(jīng)PBS(對照組)或氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(實驗組)刺激24小時后,ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TSLP的濃度。分離并培養(yǎng)人樹突狀細胞(DCs)與初始CD4+T細胞。人D

2、Cs與上述培養(yǎng)上清或PBS共孵育24小時后,去除上清,收集細胞。DCs在加入抗TSLP中和抗體(TSLP抗體組)或?qū)φ罩泻涂贵w(對照抗體組)的Transwell系統(tǒng)中與初始CD4+T細胞共培養(yǎng)5天后,加入抗CD3抗體孵育24小時后,流式細胞術(shù)檢測Th17細胞比例,ELISA方法檢測上清Th17細胞因子(IL-17、IL-22及TNF-α)表達。
　　結(jié)果:與對照組Th17細胞(0.87±0.22)％相比較,實驗組Th17細胞比例明

3、顯增加(9.88±2.16)%(P<0.001);與對照中和抗體組Th17細胞(9.25±1.83)%相比較,TSLP中和抗體組能明顯抑制ox-LDL誘導的Th17細胞(3.42±1.15)%(P<0.001)。與PBS對照組IL-17(107.53±38.69)pg/ml、IL-22(1.51±0.21)pg/ml和TNF-α(0.26±0.02)pg/ml相比較,ox-LDL實驗組細胞培養(yǎng)上清IL-17(792.17±9.67)pg

4、/ml(P<0.001)、IL-22(7.43±0.95)pg/ml(P<0.01)和TNF-α(3.54±0.35)pg/ml(P<0.001)水平明顯增加;與對照組中和抗體組細胞上清IL-17(744.05±65.64)pg/ml、IL-22(6.37±0.64)pg/ml和TNF-α(3.43±0.21)pg/ml相比較,TSLP中和抗體組細胞上清IL-17(390.22±47.33)pg/ml(P<0.001)、IL-22(3.

5、85±0.71)pg/ml(P<0.001)和TNF-α(2.38±0.32)pg/ml(P<0.01)。
　　結(jié)論:Ox-LDL體外誘導人血管平滑肌細胞產(chǎn)生TSLP可誘導DCs促進CD4+T細胞向Th17細胞亞群分化。
　　第二部分胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素對小鼠巨噬細胞抗原提呈功能及炎性分泌功能的影響
　　目的:研究胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)對小鼠巨噬細胞抗原提呈能力及炎性分泌功能的影響和可能作用機制。

6、　　方法:分離野生型C57B小鼠及TSLPR基因敲除(TSLPR-/-)C57B小鼠腹腔巨噬細胞,給予TSLP進行刺激。采用流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞MHCⅡ、CD86的表達;采用實時定量PCR以及ELISA方法檢測小鼠巨噬細胞內(nèi)以及培養(yǎng)上清液炎癥因子MCP-l、TNF-α、IL-10的表達。
　　結(jié)果:與野生型對照組比較,野生型實驗組小鼠巨噬細胞表面抗原提呈分子(MHCⅡ,CD86)表達明顯升高,炎癥因子MCP-1、TNF-α表達及

7、分泌均增高,IL-10表達及分泌無明顯變化;與TSLPR基因敲除對照組相比較,TSLPR基因敲除小鼠巨噬細胞經(jīng)TSLP刺激后細胞表面抗原提呈分子(MHCⅡ,CD86)表達及炎癥因子(MCP-1、TNF-α和IL-10)的表達及分泌均無明顯變化;與野生型實驗組相比較,TSLPR基因敲除可明顯抑制TSLP誘導的小鼠巨噬細胞抗原提呈分子增加以及炎癥因子表達。
　　結(jié)論:TSLP可通過與TSLPR結(jié)合促進小鼠巨噬細胞活化,增加巨噬細胞抗原

8、遞呈能力,產(chǎn)生炎癥因子,促使小鼠巨噬細胞向促炎巨噬細胞表型M1型轉(zhuǎn)化。
　　第三部分胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素在氧化型低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞的pyroptosis中的作用
　　目的:研究胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)對氧化型低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞pyroptosis的作用和機制。
　　方法:分離、培養(yǎng)人單核巨噬細胞ox-LDL(100ug/ml)共培養(yǎng)48小時。采用Westernblot及酶底物方法檢測活化型天

9、冬半胱氨酸酶-1(caspase-1)的表達;采用LDH流出及CalceinAM/EthDⅢ檢測細胞死亡,TUNEL熒光染色檢測TUNEL陽性細胞,ELISA方法檢測細胞因子因子IL-1β及IL-18的表達。給予非特異性caspase-1阻斷劑、特異性caspase-1阻斷劑、TSLP中和抗體或?qū)φ罩泻涂贵w后,檢測ox-LDL誘導巨噬細胞后上述指標的表達。
　　結(jié)果:
　　1.與PBS對照組比較,ox-LDL可誘導巨噬細胞表

10、達活化型caspase-1。
　　2.LDH流出及CaceinAM/EthDⅢ檢測表明與PBS對照組比較,ox-LDL可誘導巨噬細胞死亡;TUNEL染色表明與PBS對照組比較,ox-LDL可誘導巨噬細胞TUNEL陽性細胞增加;ELISA表明與PBS對照組比較,ox-LDL可誘導巨噬細胞IL-1β及IL-18水平增高。
　　3.與非特異性caspase-1阻斷劑相比較,特異性caspase-1阻斷劑能夠顯著抑制ox-LDL誘導