1型固有淋巴細(xì)胞促動脈粥樣硬化作用與機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分:
　　第一部分:AS時(shí)固有淋巴細(xì)胞各亞群的表型鑒定及比例
　　目的：探索動脈粥樣硬化（AS）時(shí)小鼠固有淋巴細(xì)胞（ILC）的表型及比例。
　　方法：采取18周齡的標(biāo)準(zhǔn)飲食的ApoE KO雄性小鼠作為正常對照，通過流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)(FACS)檢測高脂喂養(yǎng)（HFD）ApoE KO雄性小鼠的AS斑塊內(nèi)及脾臟中固有淋巴細(xì)胞（ILC）的表達(dá)，然后用定量聚合酶連鎖反應(yīng)技術(shù)（RT q-PCR）檢測該細(xì)胞的基因表達(dá)，

2、用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測該細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的濃度。
　　結(jié)果：在AS時(shí)，小鼠脾臟中ILC各群比例均有所升高，且Lin-CD127+ST2-c-kit-表型的細(xì)胞升高較為明顯。Lin-CD127+ST2-c-kit-表型的固有淋巴細(xì)胞表達(dá)較高的TH1樣的轉(zhuǎn)錄因子T-bet和細(xì)胞因子IFN-γ,IL-1β以及IL-6，較低的轉(zhuǎn)錄因子GATA3,RORγT以及細(xì)胞因子IL-13,IL-5和IL-17A，但是無granzyme B

3、,CD56和IL-15R的表達(dá)。
　　結(jié)論：由于AS時(shí)Lin-CD127+ST2-c-kit-表型的固有淋巴細(xì)胞比例升高，并且其表達(dá)的細(xì)胞因子與TH1作用于AS的細(xì)胞因子相同，這說明可能存在著一群與TH1類似的固有淋巴細(xì)胞-ILC1參與了AS的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分:1型固有淋巴細(xì)胞促進(jìn)小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成
　　目的：探索1型固有淋巴細(xì)胞是否參與小鼠AS斑塊形成
　　方法：標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的ApoE KO小鼠作

4、為對照組，通過FACS檢測AS小鼠脾臟中固有淋巴細(xì)胞各個群的百分比例。尾靜脈注射抗NK1.1抗體以清除ApoE-Rag1DKO小鼠體內(nèi)1群固有淋巴細(xì)胞（ILC1s和cNK自然殺傷免疫細(xì)胞），尾靜脈注射抗IL-15R以清除ApoE-Rag1DKO小鼠的cNK細(xì)胞。流式分選獲取ApoE-Rag1DKO小鼠脾臟中的ILC1s，然后主動轉(zhuǎn)輸給抗NK1.1抗體處理的ApoE-Rag1DKO小鼠。對主動脈根部和整個降主動脈進(jìn)行油紅染色，觀察并分析斑

5、塊的面積。
　　結(jié)果：HFD喂養(yǎng)ApoE KO小鼠的脾臟中ILC的百分比較標(biāo)準(zhǔn)飲食的ApoE KO小鼠的脾臟中ILC的百分比有所增加，并且主要以ILC1為主。通過油紅染色，清晰地觀察到接受靜脈注射抗NK1.1抗體的ApoE-Rag1DKO小鼠斑塊面積較只接受抗IL-15R的ApoE-Rag1DKO小鼠斑塊面積有所減少。并且接受靜脈注射抗NK1.1抗體的ApoE-Rag1DKO小鼠在主動轉(zhuǎn)輸從ApoE-/-TLR4+/+小鼠獲得的I

6、LC1s后斑塊面積增加。
　　結(jié)論：Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s存在于AS的發(fā)展中，且具有促AS進(jìn)展的作用。
　　第三部分:1型固有淋巴細(xì)胞促進(jìn)小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成依賴TL4的表達(dá)
　　目的：探討Toll樣受體4（TLR4）是否介導(dǎo)1型固有淋巴細(xì)胞作用于小鼠AS斑塊的形成。
　　方法：首先利用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s，Lin-CD127+ST2+

7、ILC2s和Lin-CD127+ST2-c-kit+ILC3s細(xì)胞中TLR4的表達(dá)。將分選出來的Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s分別與pam3CSK4（500ng/mL，TLR2激動劑），polyI：C（10μg/ml，TLR3激動劑）和LPS（100ng/ml，TLR4激動劑）和ox-LDL（25ug/ml）共培養(yǎng)3天，然后用ELISA檢測上清液中分泌的IL-1β，IL-6，IFN-γ的濃度。ApoE KO小鼠或Ap

8、oE-TLR4DKO小鼠脾臟進(jìn)行流式分選出Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1，然后分別主動轉(zhuǎn)輸給抗NK1.1處理的ApoE-Rag1DKO小鼠。通過油紅O染色，測定主動脈根部及全降主動脈AS斑塊面積并進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果：3個固有淋巴細(xì)胞亞型中，只有Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s表達(dá)TLR4，并且與LPS/OxLDL作用后可促進(jìn)其致炎因子的分泌?？筃K1.1抗體處理的ApoE-Rag1DKO小

9、鼠在主動轉(zhuǎn)輸從ApoE KO小鼠的ILC1s后斑塊面積將會增加，而在主動轉(zhuǎn)輸從ApoE-TLR4DKO小鼠的ILC1s后斑塊面積無明顯變化。
　　結(jié)論：ILC1s有促進(jìn)AS的作用，且這一促進(jìn)作用依賴于TLR4的表達(dá)。
　　第四部分:OxLDL對1型固有淋巴細(xì)胞功能的影響及信號機(jī)制
　　目的：探索OxLDL對1型固有淋巴細(xì)胞功能的影響及信號機(jī)制。
　　方法：利用ApoE KO小鼠和ApoE-TLR4DKO小鼠進(jìn)行研

10、究。通過Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測ApoE KO小鼠和ApoE-TLR4DKO小鼠脾臟Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s與LPS/OxLDL共同作用下TLR4及相應(yīng)BACH2的表達(dá)。用ELISA試驗(yàn)檢測Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s與不同劑量LPS/OxLDL共同作用后分泌的IFN-γ、IL-1β、IL-6的濃度，并用Western檢測在相同條件下轉(zhuǎn)錄因子BACH2的表達(dá)。
　　結(jié)果：LPS

11、/OxLDL可上調(diào)ApoE KO小鼠Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s TLR4同時(shí)下調(diào)BACH2的表達(dá)，并分泌一定量的致炎因子，但ApoE-TLR4DKO小鼠的Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s未見有致炎因子的分泌。高劑量的LPS/OxLDL的刺激ApoE KO小鼠Lin-CD127+ST2-c-kit-ILC1s可分泌較多的致炎因子，在此同時(shí)，檢測到其轉(zhuǎn)錄因子BACH2的表達(dá)是降低的。
　　結(jié)論