CTRP9抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心血管疾病和卒中的主要病因。既往研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊血栓形成及斑塊破裂可導(dǎo)致心肌梗死、卒中和猝死。因此，斑塊易損性已成為國(guó)內(nèi)外冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的研究熱點(diǎn)。
　　炎癥是目前公認(rèn)的一個(gè)參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展，動(dòng)脈斑塊破裂和血栓形成的重要因素。其中，巨噬細(xì)胞是關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞，參與動(dòng)脈粥樣硬化的每一個(gè)階段，從斑塊形成，斑塊破裂到血栓形成，并廣泛存在于動(dòng)脈粥

2、樣硬化斑塊中。巨噬細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子及多種炎癥因子，如白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)，白細(xì)胞介素8(Interleukin-8，IL-8)，單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotacticprotein-1，MCP-1)，腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)等。在這些炎癥因子的作用下，更多的單核細(xì)胞浸入內(nèi)皮下，加劇炎癥反應(yīng)并形成動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期斑塊。此外，巨噬

3、細(xì)胞對(duì)斑塊形態(tài)大小、壞死核心形成及“薄”纖維帽等易損斑塊特征性改變亦至關(guān)重要。因此，探究影響巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子是防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的關(guān)鍵。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織不僅是機(jī)體的能量貯存器官，更具有重要的內(nèi)分泌功能。脂肪細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，包含脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)、抗素(Resistin)、C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白(C1q/Tumor necrosis factor relatedprotei

4、ns，CTRPs)等。其中，C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(C1q/Tumor necrosisfactor related protein9，CTRP9)是一種新型脂肪細(xì)胞因子，屬于腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白家族（CTRP）成員之一，且與APN高度同源。既往文獻(xiàn)報(bào)道，APN具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凋亡、抗糖尿病等多種生物學(xué)功能，且與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性密切相關(guān)。最新研究顯示脂肪細(xì)胞因子CTRP9亦與心血管疾病密切相關(guān)。研究證實(shí)CTRP9

5、可顯著降低血管平滑肌細(xì)胞的增殖和新生內(nèi)膜形成，并可誘導(dǎo)血管舒張。另?yè)?jù)臨床研究顯示，血清CTRP9水平與2型糖尿病患者血糖利用及動(dòng)脈僵硬度相關(guān)。本課題組前期研究顯示，血清CTRP9與急性冠脈綜合征顯著負(fù)相關(guān)。以上信息均提示CTRP9可能參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及發(fā)展。然而，CTRP9對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)及斑塊穩(wěn)定性的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。終上所述，這些科學(xué)問(wèn)題即構(gòu)成本課題的研究目的及設(shè)計(jì)思路。
　　研究目的：(1)探討脂肪細(xì)胞

6、因子CTRP9對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　(2)闡明CTRP9促進(jìn)斑塊穩(wěn)定性作用的新靶點(diǎn)。3實(shí)驗(yàn)方法
　　3.1動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠動(dòng)物模型構(gòu)建
　　8周齡雄性ApoE-/-小鼠，全程高脂喂養(yǎng)（0.25％膽固醇和15％黃油），行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管(內(nèi)徑0.33mm，外徑0.50mm，長(zhǎng)度2mm)置入術(shù)，促進(jìn)頸動(dòng)脈斑塊形成。套管術(shù)后8周，隨機(jī)分為3組:LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組:頸靜脈注

7、射攜帶CTRP9基因的慢病毒，病毒總量為2×107 TU/只，體積為100μL; LV-eGFP陰性病毒對(duì)照組:頸靜脈注射攜帶GFP基因的慢病毒，病毒總量為2×107 TU/只，體積為100μL; Vehicle空白對(duì)照組:頸靜脈注射等體積PBS稀釋液，體積為100μL。頸靜脈注射4周后，給予小鼠安樂(lè)死。
　　3.2血糖，血脂檢測(cè)
　　動(dòng)物處死前，空腹采血，收集血清，檢測(cè)血糖(GLU)，游離脂肪酸(NEFA)，甘油三酯(TG

8、)，總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。
　　3.3易損指數(shù)
　　慢病毒轉(zhuǎn)染30天后取材。取小鼠右側(cè)頸動(dòng)脈制成冰凍標(biāo)本，5μm厚冰凍切片行特殊染色（HE染色、油紅O染色、天狼猩紅染色）;免疫組化染色方法檢測(cè)斑塊內(nèi)MOMA-2，α-SMA蛋白表達(dá)情況。Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性面積占動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積百分比。根據(jù)公式計(jì)算易損指數(shù)。易損指數(shù)=（巨噬細(xì)

9、胞相對(duì)含量+脂質(zhì)相對(duì)含量）/(平滑肌相對(duì)含量+膠原相對(duì)含量）。
　　3.4免疫組化
　　免疫組化方法檢測(cè)斑塊局部炎癥因子表達(dá):如TNF-α，MCP-1。Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性面積占動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積百分比。
　　3.5細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染
　　培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞(培養(yǎng)基為DMEM+10％FBS，溫度37℃，氣體條件5％CO2)。分別用攜帶CTRP9基因的慢病毒與攜帶

10、GFP對(duì)照基因的慢病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞;72小時(shí)后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h，檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)變化。
　　3.6 Western Blot
　　收集細(xì)胞及培養(yǎng)基，并提取蛋白。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞CTRP9蛋白表達(dá)水平及巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α和MCP-1蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用Image J軟件分析。
　　3.

11、7統(tǒng)計(jì)分析
　　所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean± SEM.）表示，兩兩比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析（ANOVA）。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，p＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　4.1.1 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血清CTRP9蛋白表達(dá)升高
　　與LV-eGFP陰性對(duì)照組比較，LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血清CTRP9水平升高3.9倍(p＜0.05);與

12、Vehicle空白對(duì)照組比較，LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血清CTRP9水平升高3.5倍(p＜0.05)，而兩對(duì)照組間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.1.2 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖、血脂水平影響
　　LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與LV-eGFP陰性病毒對(duì)照組小鼠比較，血清血糖水平下降(p＜0.05);LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與Vehicle空白對(duì)照組小鼠比較，血清血糖水平下降(p＜0.05)，而兩對(duì)照組間比較無(wú)顯

13、著差異(p＞0.05)。LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與兩對(duì)照組小鼠比較，血脂水平未見(jiàn)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.1.3 CTRP9可增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性
　　LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與兩對(duì)照組小鼠比較，脂質(zhì)及巨噬細(xì)胞含量降低(p＜0.05)，平滑肌及膠原含量增加(p＜0.05），斑塊易損指數(shù)下降(p＜0.05）;兩對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.1.4 CTRP9可減少斑塊局部炎癥因子表

14、達(dá)
　　LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠與兩對(duì)照組小鼠比較，斑塊局部炎癥因子TNF-α和MCP-1蛋白表達(dá)下降(p＜0.05);兩對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　4.2.1 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞及培養(yǎng)基中有CTRP9蛋白表達(dá)
　　慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞，當(dāng)MOI=60時(shí)，轉(zhuǎn)染效率近90％。與兩對(duì)照組比較，LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組小鼠巨噬細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)基中均可檢測(cè)到CTRP

15、9蛋白。
　　4.2.2 LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)降低4
　　與LV-eGFP組比較，LV-CTRP9實(shí)驗(yàn)組RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α和MCP-1表達(dá)降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論：(1)提高血清CTRP9蛋白水平可顯著降低斑塊局部脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞含量，增加膠原和平滑肌細(xì)胞含量，從而降低斑塊易損性;
　　(2)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)CTRP9可通過(guò)降低斑塊局部炎癥因子TNF-α和MCP