長(zhǎng)期EECP的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)被公認(rèn)為一種具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過(guò)程。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。作為動(dòng)脈粥樣硬化病變獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，高膽固醇血癥促進(jìn)脂質(zhì)的過(guò)氧化，所形成的氧化修飾低密度脂蛋白(OX-LDL)為內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵成分。 增強(qiáng)型體外反搏(EnhancedexternalcounterpulsationEECP)作為一種無(wú)創(chuàng)的體外輔助循環(huán)裝置，它為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管

2、病人尤其是那些不適合冠脈血運(yùn)重建手術(shù)或傳統(tǒng)藥物療效欠佳的病人提供了一項(xiàng)有效的治療措施。 研究目的： 1.通過(guò)高膽固醇喂飼實(shí)驗(yàn)豬建立高脂血癥及早期動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。 2.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)豬有效的體外反搏裝置，參照臨床標(biāo)準(zhǔn)療程，建立長(zhǎng)期體外反搏動(dòng)物模型，并測(cè)量計(jì)算血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和剪切應(yīng)力。 3.觀察高脂血癥實(shí)驗(yàn)豬動(dòng)脈粥樣硬化病理形態(tài)學(xué)改變及長(zhǎng)期EECP對(duì)高脂血癥豬動(dòng)脈粥樣硬化病理形態(tài)的影響。 4.觀察高脂

3、血癥實(shí)驗(yàn)豬血管內(nèi)皮形態(tài)與功能的變化，研究長(zhǎng)期EECP對(duì)高脂血癥實(shí)驗(yàn)豬血管內(nèi)皮形態(tài)與功能的影響，并檢測(cè)eNOS、Vcam-1表達(dá)的變化。 5.觀察高脂血癥實(shí)驗(yàn)豬冠狀動(dòng)脈血管重塑情況，研究長(zhǎng)期EECP對(duì)高脂血癥實(shí)驗(yàn)豬冠狀動(dòng)脈血管重塑(內(nèi)膜增生)的影響，并探討MAPK、AKT/NF-κB信號(hào)途徑在其中的作用。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)55頭雄性乳豬分四批隨機(jī)分為3組：1.正常對(duì)照組，飼以普通飼料15周；2.高脂對(duì)

4、照組，飼以高膽固醇飼料15周；3.高脂反搏組，同時(shí)同量飼以高膽固醇飼料15周，并在高脂飲食8周血脂升高后開(kāi)始進(jìn)行體外反搏干預(yù)，每次2小時(shí)，隔天1次，共反搏36小時(shí)。 2.血脂測(cè)量：于實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)、反搏前、反搏中期、反搏療程結(jié)束時(shí)抽取靜脈血檢測(cè)血清總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白變化。 3.EECP及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)：EECP裝置由空氣壓縮機(jī)、檢測(cè)儀和氣囊組成，設(shè)置反搏氣囊充氣壓力為0.035Mpa/cm2。用彩色

5、多普勒超聲診斷儀測(cè)量反搏前、反搏中豬右肱動(dòng)脈血流速度及內(nèi)徑等參數(shù)。頸動(dòng)脈插管多導(dǎo)生理記錄儀測(cè)量有關(guān)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)并同時(shí)抽血測(cè)量全血粘度。 4.實(shí)驗(yàn)豬主動(dòng)脈大體蘇丹Ⅲ脂肪染色標(biāo)本制作及檢測(cè)：主動(dòng)脈中下段甲醛固定后，行蘇丹Щ脂肪染色，脂質(zhì)條紋及斑塊處呈典型橘紅色，攝像，用彩色圖像攝錄輸入儀和全自動(dòng)圖像分析儀測(cè)定主動(dòng)脈斑塊面積、內(nèi)膜總面積及其比值。 5.掃描電鏡、透射電鏡觀察冠狀動(dòng)脈血管腔面超微結(jié)構(gòu)，6.組織形態(tài)學(xué)測(cè)量：取冠狀

6、動(dòng)脈前降支開(kāi)口以遠(yuǎn)0.5cm處長(zhǎng)約1cm血管段橫切成3-4小段，甲醛固定后常規(guī)包埋，制作蠟塊，繼而4-6μm厚橫截面切片行HE染色、醛品紅法彈力纖維染色、V-G膠原纖維染色及免疫組織化學(xué)檢查。 全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量?jī)?nèi)膜、部分中膜紅色V-G膠原染色陽(yáng)性面積及總面積，求百分比，取平均值即為膠原纖維指數(shù)。 7.免疫組織化學(xué)檢查：上述冠脈前降支石蠟切片，采用SABC法或Elivision法檢測(cè)如下抗原在冠狀動(dòng)脈中的表達(dá)：α-a

7、ctin抗體標(biāo)記血管平滑肌細(xì)胞，全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量?jī)?nèi)膜平滑肌細(xì)胞指數(shù)?？乖鲋臣?xì)胞核抗原(PCNA)抗體檢測(cè)處于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分平滑肌細(xì)胞增殖，全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比。 8.冠狀動(dòng)脈石蠟切片免疫熒光激光共聚焦掃描檢測(cè)冠狀動(dòng)脈NF-κB的蛋白表達(dá)水平。 9.收刮主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)行基因芯片檢測(cè)后RT-PCR檢測(cè)主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1mRNA表達(dá)水平。 10

8、.剪取主動(dòng)脈弓組織提取蛋白行Western-blot檢測(cè)eNOS蛋白表達(dá)水平，phospho-ERK1/2/total-ERK1/2、phospho-p38MAPK/total-p38MAPK、phospho-AKT/total-AKT、phospho-NF-κB/total-NF-κB的蛋白表達(dá)情況。并采用actin作為內(nèi)參照。 結(jié)果： 1.通過(guò)高膽固醇喂飼成功建立了高脂血癥和早期動(dòng)脈粥樣硬化模型。 2.成功建

9、立了長(zhǎng)期EECP動(dòng)物模型，達(dá)到了有效反搏的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：指脈波監(jiān)測(cè)示典型舒張期增壓波，D/S比大于1.2。彩色多普勒超聲測(cè)量示反搏時(shí)血流速度明顯加快，經(jīng)計(jì)算反搏時(shí)舒張期血流剪切應(yīng)力峰值約為反搏前的兩倍。 3.高脂對(duì)照組主動(dòng)脈大體標(biāo)本、冠狀動(dòng)脈顯微鏡觀察均發(fā)現(xiàn)典型早期粥樣硬化病灶，高脂反搏組動(dòng)脈粥樣硬化病理形態(tài)學(xué)改變減輕，主動(dòng)脈斑塊/內(nèi)膜面積比顯著下降。 4.高脂對(duì)照組冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮形態(tài)發(fā)生改變，排列紊亂，高脂反搏組內(nèi)皮改

10、變明顯減輕，內(nèi)皮細(xì)胞趨向于沿血流方向平行排列，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)指數(shù)顯著下降。高脂對(duì)照組伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的變性凋亡甚至脫落，eNOS免疫組化染色陽(yáng)性面積及密度明顯減少，積分光密度比明顯較正常對(duì)照組下降，而高脂反搏組上述免疫組化改變減輕，積分光密度比較高脂對(duì)照組增高。 高脂對(duì)照組伴隨著斑塊的隆起和內(nèi)膜的增厚，VCAM-1染色陽(yáng)性面積及密度明顯增高，積分光密度比明顯較正常對(duì)照組增高；而高脂反搏組內(nèi)膜中膜陽(yáng)性染色明顯淺淡，積分光密度比較高脂對(duì)

11、照組顯著降低。 5.冠狀動(dòng)脈血管重塑指標(biāo)分析示高脂血癥顯著誘發(fā)了高脂對(duì)照組實(shí)驗(yàn)豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增生及斑塊形成，內(nèi)/中膜面積比明顯增高；內(nèi)皮細(xì)胞和部分平滑肌細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)增高，中膜平滑肌細(xì)胞大量增生，穿破內(nèi)彈力膜向內(nèi)膜遷移，內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞指數(shù)較正常對(duì)照組明顯增高，膠原纖維在增厚的內(nèi)膜內(nèi)大量增生，膠原纖維染色陽(yáng)性面積比比正常對(duì)照組顯著增高；但在高脂反搏組內(nèi)膜增生及斑塊形成得到一定程度的抑制：內(nèi)/中膜面積比顯著下降。內(nèi)皮細(xì)胞和部分

12、平滑肌細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)降低，內(nèi)膜中平滑肌細(xì)胞指數(shù)較高脂對(duì)照組降低，由高脂血癥誘發(fā)的平滑肌細(xì)胞異常增殖和移行得到一定程度的抑制。 6.MAPK蛋白活性的變化：冠狀動(dòng)脈免疫組化染色可見(jiàn)高脂對(duì)照組增厚的內(nèi)膜內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞核內(nèi)大量表達(dá)phosph-ERK1/2蛋白，高脂反搏組上述改變減輕。Western-blot免疫印跡發(fā)現(xiàn)各組的總ERK1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，磷酸化phospho-ERK1/2蛋白表達(dá)在高脂對(duì)照組

13、較正常對(duì)照組增高，故ERK1/2活性(磷酸化ERK1/2占總ERK1/2百分比)顯著增高。而高脂反搏組ERK1/2活性水平顯著低于高脂對(duì)照組，由高脂血癥誘發(fā)的ERK1/2活性異常增高在高脂反搏組得到一定程度的抑制。 冠狀動(dòng)脈免疫組化染色可見(jiàn)高脂對(duì)照組增厚的內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞和其下方的平滑肌細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)phospho-p38MAPK蛋白磷酸化，高脂反搏組上述改變減輕。Western-blot免疫印跡發(fā)現(xiàn)各組的總p38MAPK蛋白表達(dá)

14、無(wú)明顯差異，磷酸化phospho-p38MAPK蛋白表達(dá)在高脂對(duì)照組較正常對(duì)照組增高，故p38MAPK活性(磷酸化p38MAPK占總p38MAPK百分比)顯著增高。而高脂反搏組p38MAPK磷酸化活性水平顯著低于高脂對(duì)照組，說(shuō)明由高脂血癥誘發(fā)的p38MAPK磷酸化活性異常增高在高脂反搏組得到一定程度的抑制。 7.AKT蛋白活性水平的變化：冠狀動(dòng)脈免疫組化染色可見(jiàn)高脂對(duì)照組增厚的內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞的胞核及胞漿內(nèi)明顯表達(dá)phosph-A

15、KT蛋白，內(nèi)皮下方的平滑肌細(xì)胞內(nèi)亦見(jiàn)表達(dá)，高脂反搏組上述改變減輕。Western-blot免疫印跡發(fā)現(xiàn)各組的總AKT蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，磷酸化phospho-AKT蛋白表達(dá)在高脂對(duì)照組較正常對(duì)照組增高，故AKT活性(磷酸化AKT占總AKT的百分比)顯著增高；而高脂反搏組AKT活性水平顯著低于高脂對(duì)照組，由高脂血癥誘發(fā)的AKT活性異常增高在高脂反搏組得到一定程度的抑制。 8.phospho-NF-κBp65及NF-κBp65蛋白表

16、達(dá)水平的變化：免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)冠狀動(dòng)脈NF-κBp65的表達(dá)：正常對(duì)照組血管壁NF-κBp65多呈無(wú)激活的靜息狀態(tài)，，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中，經(jīng)FITC標(biāo)記為綠色。高脂對(duì)照組斑塊處可見(jiàn)大量NF-κBp65表達(dá)于變大變圓的血管內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮下增生的平滑肌細(xì)胞的胞漿中，且活化易位入核，呈現(xiàn)紅色的核區(qū)中綠色熒光，疊加為黃色熒光。測(cè)定單位面積平均細(xì)胞核熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照組；高脂反搏組內(nèi)皮細(xì)胞也可見(jiàn)一定程度的NF-κBp

17、65表達(dá)與激活，單位面積平均細(xì)胞核熒光強(qiáng)度明顯低于高脂對(duì)照組。 結(jié)論： 1.通過(guò)高膽固醇喂飼可成功建立實(shí)驗(yàn)豬早期動(dòng)脈粥樣硬化模型。 2.成功建立了長(zhǎng)期EECP動(dòng)物模型，采用新型設(shè)計(jì)囊套可在實(shí)驗(yàn)豬身上達(dá)到理想的血流動(dòng)力學(xué)效果。EECP可在生理范圍內(nèi)明顯提高在體脈動(dòng)血流剪切應(yīng)力。 3.長(zhǎng)期EECP可改善高脂血癥實(shí)驗(yàn)豬動(dòng)脈粥樣硬化病理形態(tài)。 4.長(zhǎng)期EECP可改善高脂血癥實(shí)驗(yàn)豬血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能，其