銀丹心腦通軟膠囊抗動脈粥樣硬化作用的實驗研究.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病如心絞痛、心肌梗死、腦卒中等的共同病理基礎，是危害生命健康最嚴重的病理生理過程之一，在發(fā)達國家被稱之為“頭號殺于”，近年來在我國的發(fā)生率也呈逐年上升的趨勢。AS的發(fā)病機制復雜，從19世紀中葉到20世紀80年代，Duguid、Virchow、Steinberg等分別提出了血栓形成學說、脂質(zhì)浸潤學說、氧化學說，從不同角度解釋了AS的形成機制。1999年，Ross提出損傷

2、反應學說，認為動脈內(nèi)膜損傷是AS病變發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，隨著對AS發(fā)生機制的深入研究，近年來這一學說得到了國內(nèi)外研究學者的普遍共識。
　　從中醫(yī)角度來看， AS是一種由心脾腎虧損，導致氣滯血瘀、痰積內(nèi)生、脈絡不通的全身性疾病，治療常采用活血化瘀等具有綜合調(diào)節(jié)功效的方劑，體現(xiàn)了中藥復方多靶點、多通路、整體調(diào)節(jié)等獨特優(yōu)勢，與AS發(fā)病機制的多樣性相契合。銀丹心腦通軟膠囊(Yindan Xinnaotong capsule，YXC)是根據(jù)苗族

3、醫(yī)學“兩病兩綱”理論研制的復方制劑，由銀杏葉、丹參、絞股藍、燈盞細辛、大蒜、三七、山楂、天然冰片8味中藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛、消食化滯等功效，臨床上主要用于心腦血管疾病，其療效肯定。針對AS的防治，目前，臨床上除采用藥物治療、控制飲食等手段外，運動鍛煉對AS的防治也日益受到人們的重視，運動可通過調(diào)節(jié)血流剪應力和血管內(nèi)皮的功能，干預AS的發(fā)生發(fā)展過程。
　　本研究首先采用高脂飼料、動脈結扎、腹腔注射維生素D3的復合方法建立A

4、S大鼠模型，基于兩因素三水甲3×3析因設計，將YXC與運動聯(lián)合應用，觀察對大鼠左頸總動脈血管病理形態(tài)，血液流變學指標及血脂水平的影響，探討YXC和運動聯(lián)合之后預防大鼠動脈粥樣硬化的作用;測定血漿中血管內(nèi)皮細胞分泌的相關因子，采用免疫組織化學方法檢測大鼠左頸總動脈SM22α的蛋白表達水平，從血管內(nèi)皮細胞功能與血管重構兩方面研究YXC和運動聯(lián)合預防大鼠AS的作用機制。體外實驗分別采用Ox-LDL、TNF-α誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)

5、損傷兩種模型， MTT法測定YXC預處理后HUVEC存活率，探討YXC對內(nèi)皮細胞的保護作用;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定YXC預處理后， HUVEC中粘附分子的表達水平，采用流式細胞儀測定YXC對內(nèi)皮細胞凋亡的影響，探討YXC內(nèi)皮保護的作用機制。為YXC的合理用藥提供科學依據(jù)。
　　內(nèi)容：
　　1.YXC和運動聯(lián)合作用對大鼠動脈粥樣硬化的影響采用高脂飼料、結扎左頸總動脈、腹腔注射維生素D3的復合方法建立AS大鼠模型，

6、按照二因素（YXC，游泳）三水平(0，1，2g·kg-1 YXC;0，0.5，1h游泳)3×3析因設計對大鼠分組，實驗共10組（9析因設計組，1假手術組）。8周后，腹主動脈采集血液測定血液流變學指標:血漿粘度、全血粘度（低切10s-1、高切200s-1）、纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)IB)、紅細胞壓積(Haematocrit，HCT)、凝血酶時間(Thrombin time，TT)，檢測血清中血脂:總膽固醇(TotalChole

7、sterol，T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）的水平。同時固定大鼠左頸總動脈血管，蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin stain，HE)染色，顯微鏡觀察血管的病理變化情況。

8、　　2.YXC與運動聯(lián)合作用抗大鼠動脈粥樣硬化機制的研究在大鼠造模并給予3×3析因設計干預措施8周后，腹主動脈取血測定血漿中一氧化氮(Nitric oxide，NO)、6-酮-前列腺素1α(6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)、內(nèi)皮素(Endothelin，ET)、血栓烷素B2(Thromboxane B2, TXB2)水平;同時固定大鼠左頸總動脈血管，DP2-BSW圖像分析軟件，在血管橫切面上測

9、量血管的內(nèi)徑、壁厚以及壁厚內(nèi)徑比（壁厚內(nèi)徑比=管壁厚/管徑），觀察不同干預措施對AS大鼠血管結構的影響，然后進行免疫組織化學染色，觀察蛋白SM22α的陽性表達，并計算相對陽性表達量，觀察不同組對血管功能性重構的影響。
　　3.YXC對Ox-LDL和TNF-α誘導的臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用研究體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umilical vein endothelial cell，HUVEC)，MTT法確定YXC的最大

10、無毒濃度和實驗濃度;同法測定腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的造模濃度;氧化低密度脂蛋白(Oxidized LDL，Ox-LDL)的造模濃度參考相關文獻。MTT法測定YXC預孵育后，對Ox-LDL和TNF-α誘導HUVEC的生存率影響。
　　200μg·mL-1 Ox-LDL和60ng·mL-1TNF-α造模，ELISA法測定細胞上清液中的細胞間粘附分子-1（Intercellular a

11、dhesion molecule-1，ICAM-1）和血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecular-1，PECAM-1）水平。
　　體外培養(yǎng)HUVEC，YXC預處理后，200μg·mL-1 Ox-LDL造模，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞術測定不同組細胞凋亡情況。
　　結果：
　　1，YXC和運動聯(lián)合作用對大鼠動脈粥樣硬化的影響

12、r>　　(1)對AS斑塊的影響 YXC與游泳可減輕動脈血管壁鈣化、減少膽固醇結晶，2g·kg-1 YXC和游泳對血管病變的改善較優(yōu);
　　(2)對血液流變學指標的影響在降低血漿粘度、高低切全血粘度、FIB方面，YXC和游泳顯示明顯交互作用(p＜0.05)，2g·kg-1 YXC和0h游泳對血漿粘度、高切全血黏度、HCT的降低優(yōu)于其他組;
　　(3)對血脂水平的影響 YXC和游泳在降低血清中T-CHO、LDL-C、TG的水平方

13、面具有明顯的交互作用(p＜0.05)，YXC升高HDL-C主效應明顯(F=4.095，p=0.023)。
　　2.YXC與運動聯(lián)合作用抗大鼠動脈粥樣硬化機制的研究
　　(1)對血管內(nèi)皮因子的影響 YXC和游泳在升高內(nèi)皮因子NO、6-keto-PGF1α水平方面交互作用顯著(p＜0.05)，在降低ET、TXB2水平上，交互作用顯著(p＜0.05);
　　(2)對血管重構的影響 YXC和游泳在降低壁厚和壁厚內(nèi)徑比方面，交互

14、作用顯著(p＜0.05);YXC和游泳可升高蛋白SM22α的表達，交互作用不明顯(F=1.632，p=0.175)，單獨游泳的主效應明顯(F=8.088，p=0.001)。
　　3.YXC對Ox-LDL和TNF-α誘導的HUVEC損傷的保護作用
　　(1) YXC的最大無毒濃度為500μg·mL-1，將250μg·mL-1、125μg·mL-1、62.5μg·mL-1三個濃度作為YXC的實驗濃度;TNF-α的造模濃度選擇60

15、ng·mL-1，作用時間為24h;
　　(2)對細胞生存率的影響YXC孵育24h后可明顯升高Ox-LDL誘導的HUVEC的存活率(p＜0.05)，具有明顯的量效關系;YXC孵育24h后可明顯升高TNF-α誘導的HUVEC的存活率(p＜0.05)，且當濃度大于125μg·mL-1時，量效關系明顯。
　　(3)對粘附分子分泌的影響 YXC可顯著降低Ox-LDL誘導的HUVEC損傷模型中PECAM-1的含量(p＜0.05)和ICA

16、M-1的含量(p＜0.05); YXC可顯著降低TNF-α誘導的HUVEC損傷模型中ICAM-1、PECAM-1含量(p＜0.05);
　　(4)對Ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡的影響YXC可降低Ox-LDL誘導的HUVEC模型中細胞的凋亡率，抑制細胞凋亡。
　　結論：
　　1.YXC與游泳聯(lián)合應用具有預防大鼠AS的作用，其作用環(huán)節(jié)可能與改善血液流變學指標、降低血脂水平、保護血管內(nèi)皮功能、抑制血管重構有關。