桑色素在動(dòng)脈粥樣硬化中抗炎作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種常見的心血管疾病，是導(dǎo)致中風(fēng)、心肌梗塞和周圍血管疾病的重要原因。目前研究顯示，炎癥導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)功能紊亂是AS的起始環(huán)節(jié)。因此，抗炎藥物研究是AS藥物治療的熱點(diǎn)方向。桑色素(morin hydrate，MO)是一種從蔬菜、水果和桑類植物中分離的黃酮類化合物，前期研究

2、已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和誘導(dǎo)凋亡等藥理作用，但是關(guān)于其是否具有抗AS作用以及具體的抗炎機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　自噬是一種存在于真核細(xì)胞內(nèi)參與蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的“自食”現(xiàn)象。大量研究證實(shí)，自噬與多種疾病有關(guān)，如心肌重塑、心臟缺血再灌注損傷、癌癥、衰老及多種神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病等。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)桑色素能夠提高細(xì)胞cAMP水平，故我們推測(cè)桑色素是否能通過激活cAMP/PKA/AMPK/SIRT1通路而誘

3、導(dǎo)HUVECs發(fā)生自噬，從而發(fā)揮抗炎作用。因此，本論文旨在研究桑色素在動(dòng)物體內(nèi)抗AS作用以及體外抗炎作用的分子機(jī)制。
　　方法：
　　體外實(shí)驗(yàn):采用TNF-α誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞炎癥損傷模型，模擬AS發(fā)生時(shí)炎癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的TNF-α和桑色素對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的影響來確定TNF-α和桑色素的實(shí)驗(yàn)濃度。采用ELISA、免疫印跡法檢測(cè)桑色素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HUVECs損傷后炎癥因子(IC

4、AM-1、MMP-9和COX-2)表達(dá)的影響;采用Western blotting法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞內(nèi)MAP1LC3B2和SQSTM1/P62的表達(dá)水平來確定MO對(duì)自噬的影響。采用自噬抑制劑(3-methyladenine、氯喹、ATG和BECN1 siRNA)、溶酶體綠色熒光探針，確證桑色素對(duì)HUVECs細(xì)胞自噬的影響;采用SIRT1的抑制劑(VPP和EX527)、ADCY抑制劑(KH7)和PDE4抑制劑(Rolipram)確定桑

5、色素對(duì)HUVECscAMP/PKA/AMPK/SIRT1信號(hào)通路的影響與其抗炎和誘導(dǎo)自噬作用的相關(guān)性。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):采用高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS模型，觀察桑色素對(duì)AS小鼠主動(dòng)脈AS粥樣斑塊形成以及血脂水平的影響。實(shí)驗(yàn)分為三組(n=6/組):2％吐溫80溶劑對(duì)照組，30mg/kg和100mg/kg桑色素組。高脂飼料喂食16周后，各組小鼠分別灌胃給藥10周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱重，眼眶取血分析血脂(TC、TG、LDL-Ch和HD

6、L-C)水平。分離主動(dòng)脈血管，油紅O染色判斷AS粥樣斑塊面積，通過與溶劑對(duì)照組比較評(píng)價(jià)桑色素體內(nèi)抗AS活性。
　　結(jié)果：
　　體外實(shí)驗(yàn):HUVECs細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α濃度≤20ng/mL、桑色素濃度≤20μM時(shí)，對(duì)HUVECs細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無明顯影響。故后續(xù)試驗(yàn)采用10ng/mL的TNF-α來誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞炎癥，觀察1、10和20μM三個(gè)劑量的桑色素對(duì)HUVECs細(xì)胞炎癥和自噬的影響。ELISA和Wes

7、tern blotting結(jié)果顯示，桑色素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子具有明顯抑制作用，呈一定的劑量依賴性。桑色素對(duì)無炎癥誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞和TNF-α誘導(dǎo)的炎癥HUVECs細(xì)胞均可誘導(dǎo)自噬作用，并抑制炎癥因子(ICAM-1、MMP-9和COX-2)表達(dá)，而桑色素的抗炎作用可被自噬抑制劑(3-MA、氯喹、ATG和BECN1 siRNA)抑制。通過檢測(cè)HUVECs細(xì)胞cAMP的釋放量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑色素可顯著提高細(xì)胞cA

8、MP釋放水平，并激活cAMP/PKA/AMPK/SIRT1通路，誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞自噬，抑制炎癥因子表達(dá)。用SIRT1抑制劑(EX527和VPP)后，桑色素誘導(dǎo)自噬作用、抑制炎癥因子表達(dá)作用均被抑制。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MO通過激活cAMP/PKA/AMPK/SIRT1通路誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞自噬來發(fā)揮抗炎作用。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):桑色素給藥10周后，與溶劑對(duì)照組比較，30mg/kg和100mg/kg桑色素組AS粥樣斑塊明顯減少，血脂