基于炎性體研究丹參酮ⅡA抗動脈粥樣硬化的分子機制.pdf

1、心腦血管疾病是威脅人類健康的重要疾病，而動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病發(fā)病的共同病理基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對AS機制的研究從大體病理深入到了細(xì)胞和分子水平，由過去認(rèn)為單是內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤、退行性疾病，轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N由多種因素導(dǎo)致的無菌炎性反應(yīng)性疾病。研究發(fā)現(xiàn)在AS斑塊組織中存在著大量炎性細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子，對AS的發(fā)生和發(fā)展起重要的調(diào)節(jié)和致病作用。
　　丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡ

2、A，TanⅡ A)是我國傳統(tǒng)中藥丹參的重要有效成分。丹參具有抗炎、改善微循環(huán)、擴張冠狀血管、抑制血小板凝集、抗血栓等方面的功效，從而被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的防治。丹參酮ⅡA是丹參重要的脂溶性有效成分，具有明顯抗AS的作用，近些年人們對丹參酮ⅡA抗AS的藥理作用進(jìn)行了廣泛研究，然而到目前為止，丹參酮ⅡA抗AS的分子機制尚未完全闡明。
　　最近研究證明，低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein choles

3、terol,LDL-Ch)介導(dǎo)的AS與膽固醇(Cholesterol，ChC)激活巨噬細(xì)胞炎性體（Inflammasome）有關(guān)。炎性體是近10年來被發(fā)現(xiàn)的存在于單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白復(fù)合體，由感受外來病原或細(xì)胞內(nèi)危險信號的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)、半胱天冬酶-1（Cysteinyl aspartate-specific protease-1，caspase-1）等組成。復(fù)

4、合體中的caspase-1可催化IL-1β前體和IL-18前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腎L-1β和IL-18并釋放到細(xì)胞外，IL-1β是介導(dǎo)組織炎癥的重要細(xì)胞因子，也是介導(dǎo)AS發(fā)生發(fā)展的重要促炎性分子。研究報道ChC可激活巨噬細(xì)胞的NLRP3炎性體，由此釋放的IL-1β被認(rèn)為是引發(fā)AS形成的重要因素。丹參酮ⅡA的抗AS作用是否與其抑制ChC誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體的激活有關(guān)，目前尚未見報道。
　　為證實丹參酮ⅡA在體內(nèi)的抗AS作用，利用A

5、poE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠，通過飼喂高脂高膽固醇飼料建立ApoE-/-小鼠AS模型，并在建模同時用丹參酮Ⅱ A處理小鼠，分析其對血脂代謝及AS斑塊形成的影響。結(jié)果顯示丹參酮ⅡA不僅可以明顯降低脂質(zhì)在ApoE-/-小鼠主動脈壁的沉積，抑制AS斑塊的形成，同時也能夠降低小鼠血清中LDL-Ch的含量。由此可見，丹參酮ⅡA具有明顯的抗ChC誘導(dǎo)AS的作用。
　　為探討丹參酮Ⅱ A抗ChC誘導(dǎo)AS的分子機制，首先應(yīng)弄清丹參酮Ⅱ A

6、能否抑制ChC對炎性體的激活，為此我們用丹參酮Ⅱ A和LPS先后處理小鼠B6巨噬細(xì)胞，然后用ChC刺激細(xì)胞，采用ELISA和Western blot方法分別檢測培養(yǎng)基IL-1β和細(xì)胞內(nèi)成熟caspase-1的含量。結(jié)果表明，用丹參酮ⅡA處理使細(xì)胞內(nèi)成熟caspase-1和培養(yǎng)基IL-1β的含量明顯降低，說明丹參酮ⅡA對ChC誘導(dǎo)炎性體的激活有明顯抑制作用，從而表現(xiàn)其抗AS的活性。
　　有研究表明，ChC可激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎性

7、體，這一激活作用被認(rèn)為與ChC引發(fā)巨噬細(xì)胞溶酶體膜破壞使組織蛋白酶B的釋放有關(guān)。為進(jìn)一步證實ChC激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體，我們利用不同炎性體激活途徑相關(guān)蛋白基因缺陷性（NLRP3-/-、 AIM2-/-、NLRC4-/-、ASC-/-和caspase-1-/-）小鼠B6巨噬細(xì)胞，分析ChC對炎性體的激活作用。結(jié)果表明，ChC可刺激AIM2-/-、NLRC4-/-B6細(xì)胞IL-1β的釋放，而不能刺激NLRP3-/-B6細(xì)胞和NLRP

8、3途徑蛋白基因敲除的B6細(xì)胞(ASC-/-細(xì)胞和caspase-1-/-細(xì)胞)IL-1β的釋放，表明ChC可激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體。為進(jìn)一步了解ChC激活炎性體是否與其引發(fā)溶酶體內(nèi)組織蛋白酶B的釋放有關(guān)和探討丹參酮ⅡA是否通過抑制ChC對溶酶體膜的破壞使組織蛋白酶B釋放減少，從而抑制炎性體的激活，我們利用cathepsin B-/-B6細(xì)胞，通過熒光抗體染色和激光共聚焦顯微鏡檢測，分析了ChC對巨噬細(xì)胞溶酶體組織蛋白酶B釋放的影響

9、和丹參酮ⅡA對其釋放的抑制作用。結(jié)果表明，ChC可明顯提高野生型B6細(xì)胞（而不是組織蛋白酶B基因缺陷性B6細(xì)胞）胞漿中組織蛋白酶B的含量，而丹參酮ⅡA可明顯降低ChC介導(dǎo)的溶酶體組織蛋白酶B的釋放。上述結(jié)果一方面表明ChC激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體與其引發(fā)溶酶體組織蛋白酶B的釋放有關(guān)，另一方面證明丹參酮ⅡA可抑制ChC引發(fā)溶酶體組織蛋白酶B的釋放，從而抑制ChC對巨噬細(xì)胞炎性體的激活。
　　另外也有研究顯示，線粒體來源的活性氧（

10、Reactive oxygen species，ROS）可以誘導(dǎo)NLRP3炎性體的激活。并且有實驗證明晶體或微?？梢哉T導(dǎo)ROS的產(chǎn)生從而激活炎性體。然而，ChC能否刺激ROS的生成進(jìn)而激活炎性體;丹參酮ⅡA能否抑制ChC刺激ROS的生成，從而抑制炎性體的激活，這些目前都尚不清楚。為了探討這些問題，我們采用DCFH-DA(2'，7'-Dichlorofluorescin diacetate為ROS的熒光檢測試劑)檢測ChC刺激后巨噬細(xì)胞中

11、ROS的生成，并探討丹參酮Ⅱ A對ChC刺激產(chǎn)生ROS的抑制作用。結(jié)果表明，在巨噬細(xì)胞中ChC對ROS的生成有一定的刺激作用，并且丹參酮ⅡA可以抑制ChC刺激ROS的生成。
　　綜上所述，丹參酮ⅡA通過阻止ChC誘導(dǎo)溶酶體組織蛋白酶B的釋放和ChC誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中ROS的生成，來抑制ChC對NLRP3炎性體的激活，從而抑制由此炎性體介導(dǎo)的AS的發(fā)生和發(fā)展。這項研究不僅為探討丹參酮ⅡA抗AS的藥理機制提供了重要的科學(xué)實驗數(shù)據(jù)，同時為我