丹參山楂組分配伍抗動(dòng)脈粥樣硬化及作用機(jī)制研究.pdf

1、心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是世界上發(fā)病率和病死率較高的疾病之一。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是導(dǎo)致CVD的重要病理基礎(chǔ)。一些中藥在臨床防治AS上有較好的療效，但是中藥研究存在的一些問題阻礙了對(duì)其的深入研究:1）中藥在臨床多以飲片形式入藥，眾多的影響因素使飲片的質(zhì)量不易控制;2）現(xiàn)代藥效評(píng)價(jià)模型不能很好地與中醫(yī)的“證”相對(duì)應(yīng);3）中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)較難體現(xiàn)等。隨著分析儀

2、器的不斷更新，其他學(xué)科理論和技術(shù)的引入，目前對(duì)上述研究中存在的問題，已經(jīng)有了一些解決對(duì)策和實(shí)踐:1）制備成分相對(duì)穩(wěn)定的中藥有效組分進(jìn)行配伍，探討組分配伍替代飲片配伍的可行性;2）生物體內(nèi)源性成分（小分子代謝物）在生理、病理及中藥治療狀態(tài)下，表達(dá)譜的改變可能反映了中醫(yī)證候規(guī)律的物質(zhì)基礎(chǔ)在代謝物水平上的變化，因此以體內(nèi)代謝物為研究對(duì)象的代謝組學(xué)，為從系統(tǒng)生物學(xué)的角度詮釋中藥的整體作用提供了研究思路;3）基于生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)角度的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，

3、可用于分析中藥多種活性成分所發(fā)揮的綜合或整合調(diào)節(jié)作用，為解析中藥多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制及配伍規(guī)律提供了新的方法。
　　 丹參山楂是中醫(yī)治療CVD的常用藥對(duì)之一，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明二者配伍在防治AS上具有較好的療效。為了更好的闡釋丹參山楂配伍的內(nèi)涵和作用機(jī)制，本研究擬從丹參山楂組分配伍入手，建立AS大鼠模型，在此基礎(chǔ)上，采用多藥效指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法，篩選丹參山楂抗AS的有效組分;進(jìn)而采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化抗AS組分

4、的配伍;另一方面，對(duì)有效組分進(jìn)行化學(xué)成分定性定量分析，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)作用機(jī)制;進(jìn)而考察較優(yōu)配伍抗AS的作用機(jī)制。
　　 1.組分的制備及其化學(xué)成分分析
　　 制備丹參山楂單煎及合煎的不同組分:丹參總糖組分(DST)、丹參總酚酸組分(DSF)、丹參脂溶性組分(DSZ);山楂糖組分(SZT)、山楂黃酮組分(SZH)、山楂脂溶性組分(SZZ);合煎糖組分(HJT)、合煎水溶性組分(HJS)、合煎脂溶性組分(HJZ)。采用HP

5、LC法對(duì)各組分中的化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析，檢出丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、蘆丁/金絲桃苷、異槲皮素、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、齊墩果酸/熊果酸等成分。定量分析結(jié)果顯示SZH中原花青素B2、表兒茶素、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素含量分別為4.84％、4.00％、0.23％、0.28％、0.14％;DSF中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A含量分別為3.50％、1.67％、64.78

6、％、0.96％; HJS中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、原花青素B2、表兒茶素的含量分別為1.93％、2.35％、0.47％、39.52％、1.74％、1.05％;DSZ中隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量分別為3.40％、5.31％;HJZ中隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量分別為3.01％、4.54％。
　　 2.抗AS有效組分的篩選
　　 2.1各組分對(duì)AS大鼠影響的考察
　　 采用高脂飼養(yǎng)、腹腔注射維生素D3及卵

7、清白蛋白誘發(fā)炎癥的復(fù)合方法建立AS大鼠模型。以辛伐他汀為陽性對(duì)照，從降脂活性(total cholesterol，TC;triglyceride，TG;high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C; low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、抗氧化活性(malondialdehyde，MDA;superoxide dismutase，SOD)、內(nèi)皮保護(hù)

8、活性(nitric oxide，NO; endothelin，ET;6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α;thromboxane B2，TXB2)、抗炎活性(C-reactive protein，CRP; interleukin8，IL-8; interleukin18，IL-18; interleukin1β，IL-1β)上考察各組分的抗AS作用（口服灌胃給藥4周），同時(shí)進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察;采用主

9、成分分析(principal component analysis，PCA)和聚類分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選有效組分;析因分析觀察丹參山楂的交互作用。結(jié)果顯示，不同組分干預(yù)后的抗AS作用不同，其中DSF降低了AS大鼠血中TC、TG、LDL-C、ET、TXB2、CRP、IL-18、IL-1β水平(P＜0.05)，升高了SOD、6-keto-PGF1α水平(P＜0.05);SZH降低了TC、TG、LDL-C、ET、TXB2、CRP、IL-8、I

10、L-18、IL-1β水平(P＜0.05)，升高了HDL-C、SOD、6-keto-PGF1α水平(P＜0.05);DSZ降低了TC、TG、LDL-C、ET、IL-1β水平，升高了6-keto-PGF1α、HDL-C、NO水平(P＜0.05); SZZ降低了TC、LDL-C、ET水平(P＜0.05);SZT降低了IL-18水平(P＜0.05)。PCA結(jié)果表明DSZ-1、DSF-4、SZH-1的綜合效應(yīng)較好，聚類分析與PCA的趨勢(shì)一致。病理

11、結(jié)果顯示DSZ-1、SZH-1、HJS-1、SZT-4的主動(dòng)脈病變較模型組明顯減輕，DSZ-1、HJS-4、SZT-4組顯著抑制了主動(dòng)脈內(nèi)膜變厚(P＜0.05);析因分析結(jié)果顯示DSF與SZH在降脂、內(nèi)皮保護(hù)、抗炎活性上存在交互作用。綜上，DSF、SZH、DSZ為丹參山楂抗AS的有效組分。
　　 2.2有效組分的代謝組學(xué)評(píng)價(jià)
　　 采用三甲基硅烷化衍生的方法，建立AS大鼠血清代謝物的GC/MS分析方法，采用PCA和偏最小

12、二乘法-判別分析(partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA)觀察代謝物輪廓變化，篩選生物標(biāo)志物，觀察有效組分的干預(yù)作用。PLS-DA結(jié)果表明，模型組與正常組可明顯地聚為兩類，與正常組比較，模型組大鼠血清乳酸、纈氨酸、甘油、異亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、核糖、酪氨酸、十七酸、肌醇、亞油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸水平顯著降低(P＜0.05)，賴氨酸和油酸水平顯著升高(P＜0.0

13、5)，表明這15個(gè)成分是差異代謝物。進(jìn)一步的分析表明，AS大鼠在脂肪酸代謝、氨基酸代謝和糖代謝通路上發(fā)生紊亂。不同有效組分在一定程度上可逆轉(zhuǎn)這種紊亂，其中SZH顯著升高了乳酸、甘油、異亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、核糖、酪氨酸、花生四烯酸、肌醇和亞油酸水平(P＜0.05或P＜0.01);DSF顯著升高了乳酸、甘油、苯丙氨酸、異亮氨酸水平(P＜0.05或P＜0.01)，降低賴氨酸水平(P＜0.01)，且呈量效關(guān)系;HJS可顯著升高乳酸、甘油

14、、異亮氨酸水平(P＜0.01)，降低賴氨酸水平(P＜0.01);DSZ可升高乳酸、甘油、異亮氨酸、酪氨酸水平(P＜0.05或P＜0.01)。與合煎相比，單味藥對(duì)代謝輪廓的回調(diào)作用較優(yōu)，提示丹參山楂合用比例和劑量需要優(yōu)化。
　　 3.抗AS有效組分配伍的研究
　　 在AS大鼠模型上，采用正交設(shè)計(jì)(L934)的方法，對(duì)DSF、SZH、DSZ高(1)、中(2)、低(3)3個(gè)劑量水平的不同配比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用多藥效指標(biāo)觀察其抗AS

15、作用;以多因素方差分析、PCA和聚類分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，各配伍組具一定的降脂、抗氧化、內(nèi)皮保護(hù)和抗炎活性;多因素方差分析結(jié)果顯示DSF(2)-SZH(2)-DSZ(1)為側(cè)重降脂的較優(yōu)配比，DSF(3)-SZH(2)-DSZ(1)為側(cè)重抗氧化的較優(yōu)配比，DSF(3)-SZH(3)-DSZ(3)為側(cè)重內(nèi)皮保護(hù)的較優(yōu)配比，DSF(3)-SZH(1)-DSZ(1)為側(cè)重抗炎較優(yōu)配比;PCA和聚類分析綜合評(píng)價(jià)結(jié)果顯示DSF(2

16、)-SZH(1)-DSZ(2)(SC121)為抗AS的較優(yōu)配伍;病理結(jié)果顯示SC121可顯著抑制主動(dòng)脈斑塊進(jìn)展，同時(shí)減輕肝臟的脂肪變性和炎性浸潤(rùn)。
　　 4.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)有效組分的作用機(jī)制
　　 采用系統(tǒng)藥理學(xué)軟件TCMSP(http://tcmspnw.com/default)，對(duì)SZH中5個(gè)主要成分進(jìn)行口服利用度和類藥性預(yù)測(cè)，提取主要成分的作用靶標(biāo)，通過搜索PharmGKb、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫，確定了與

17、CVD密切相關(guān)的靶標(biāo)20個(gè)，這些靶標(biāo)涉及花生四烯酸代謝、精氨酸/一氧化氮、過氧化物增殖物受體和血小板聚集等通路。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)丹參網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，推測(cè)上述有效組分配伍的主要作用靶位為內(nèi)皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞及血小板等，介質(zhì)為脂質(zhì)，此預(yù)測(cè)結(jié)果與整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。
　　 5.較優(yōu)配伍方的作用機(jī)制研究
　　 采用體外Ox-LDL和H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veinendothelia

18、l cells，HUVEC)損傷模型評(píng)價(jià)SC121的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SC121可提高HUVEC細(xì)胞存活率(P＜0.05或P＜0.01)，并呈一定的劑量依賴性。
　　 采用Ox-LDL和H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7損傷模型評(píng)價(jià)SC121的保護(hù)作用;采用熒光素法測(cè)定SC121對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響;采用油紅O染色法評(píng)價(jià)SC121對(duì)RAW264.7泡沫化形成的影響。結(jié)果顯示，SC121可提高RAW264.

19、7細(xì)胞存活率(P＜0.05或P＜0.01)，及抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和泡沫化的形成，并呈一定的劑量依賴性。
　　 綜上所述，本論文以AS大鼠模型為基礎(chǔ)，從丹參山楂組分配伍入手，通過多藥效指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法，篩選出了丹參山楂抗AS的有效組分(DSF、SZH、DSZ)，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了定性定量分析;通過正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定了較優(yōu)配伍SC121;以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了有效組分的作用靶位為內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞等。體外結(jié)果表明，S