連接粘附分子樣蛋白JAML在急性腎損傷中的作用.pdf

1、研究目的與意義
　　急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)已成為全球性的公共健康問題，其死亡率居高不下且極易發(fā)展為慢性腎病及終末期腎病。其常見的誘因包括:腎缺血再灌注、腎毒性藥物、膿毒癥等。
　　急性腎損傷的病理生理學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，免疫炎癥反應(yīng)在急性腎損傷中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。急性腎損傷后腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，釋放損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pat

2、terns，DMAP)，后者被模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別進(jìn)而激活固有免疫反應(yīng)。同時，腎小管上皮細(xì)胞也表現(xiàn)出免疫細(xì)胞的活性，一方面產(chǎn)生炎性介質(zhì)，另一方面表達(dá)模式識別受體和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子等。腎小管周圍的微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，表達(dá)粘附分子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的粘附和遷移。此外，各種免疫炎癥細(xì)胞在損傷區(qū)域浸潤，進(jìn)一步活化釋放大量炎性介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)放大以及腎小管

3、上皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷。腎組織內(nèi)這三大類效應(yīng)細(xì)胞相互影響，共同參與了腎臟局部固有免疫及適應(yīng)性免疫功能紊亂，導(dǎo)致腎臟持續(xù)處于過度炎性狀態(tài)，是引起急性腎損傷的主要機(jī)制。
　　近年來，連接黏附樣分子蛋白(junctional adhesion molecule-like protein，JAML，amica1)在免疫細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)中的作用日益受到重視。JAML作為新型的連接黏附分子，是一種分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白。其結(jié)構(gòu)特點使它不僅可以介

4、導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，而且可以與細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合從而介導(dǎo)下游信號通路。然而，JAML在急性腎損傷中是否扮演著重要角色，迄今仍未見報道。所以，探討JAML在急性腎損傷中的作用有非常重要的意義。本課題將探討JAML如何參與腎臟區(qū)域免疫調(diào)節(jié)，為闡明腎臟的免疫學(xué)機(jī)制，尋找新的免疫治療靶點提供理論依據(jù)。
　　研究方法
　　1.JAML在腎缺血再灌注小鼠模型中的表達(dá)變化
　　1.1體內(nèi)模型的建立及JAML的檢測
　　用雄性野生型(

5、wild type，WT) C57BL/6小鼠構(gòu)建急性腎缺血再灌注模型，用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot，WB)、實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Real-time RT-PCR)以及免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)檢測JAML在腎缺血再灌注各組織中的表達(dá)變化;另外腹腔注射順鉑構(gòu)建急性腎損傷模型，并用IHC檢測JAML的表達(dá)變化。
　　1.2 JAML與腎小管不同部位標(biāo)記物共定位

6、r>　　用組織免疫熒光法(immunofluoresce，IF)對JAML與腎小管標(biāo)記物蛋白進(jìn)行熒光共定位。
　　1.3體外模型的建立及JAML的檢測
　　培養(yǎng)人近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2），體外模擬腎缺血再灌注模型:糖氧剝奪法(oxygen glucose deprivation，OGD);給藥抗霉素A/2-脫氧葡萄糖（AA-2DG）;給藥氯化鈷(CoCl2)。WB檢測這幾種條件下HK-2細(xì)胞中JAML蛋白水平變化。另外，

7、通過缺氧處理的HK-2細(xì)胞復(fù)氧后，用其上清處理巨噬細(xì)胞，WB檢測巨噬細(xì)胞中JAML的蛋白水平變化。
　　2.JAML在小鼠腎缺血再灌注損傷中的作用
　　2.1野生型與JAML-/-小鼠腎臟功能學(xué)指標(biāo)的對比
　　高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）檢測野生型與JAML-/-(JAML knockout)小鼠血清中肌酐含量。羅氏Cobas8000全自動生化

8、分析儀分析野生型與JAML-/-小鼠血清中尿素氮的含量。
　　2.2野生型與JAML-/-小鼠腎臟形態(tài)學(xué)損傷的對比
　　蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)對野生型與JAML-/-小鼠的腎臟石蠟切片進(jìn)行染色，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)損傷評分。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling，TUNE

9、L)檢測野生型和JAML-/-小鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況。
　　2.3小鼠腎缺血再灌注模型炎癥指標(biāo)檢測
　　Real-time RT-PCR檢測野生型與JAML--小鼠腎臟炎癥因子的含量。IHC檢測野生型和JAML-/-小鼠腎臟切片巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68、中性粒細(xì)胞標(biāo)記蛋白Ly6B。
　　3.在腎缺血再灌注損傷中JAML對下游分子Clec4e的影響
　　通過基因芯片技術(shù)分析腎缺血再灌注野生型和JAML-/-小鼠間的差

10、異表達(dá)基因，并繪制模式識別受體家族分子熱圖。Real-time RT-PCR對篩選出來的基因做進(jìn)一步驗證。RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞與HK-2細(xì)胞中模式識別受體Clec4e的表達(dá)變化。進(jìn)而，用AA/2-DG刺激HK-2細(xì)胞觀察Clec4e的變化。
　　研究結(jié)果
　　1.JAML在腎缺血再灌注模型中的表達(dá)變化
　　1.1小鼠腎缺血再灌注模型中JAML的表達(dá)水平顯著上升
　　RT-PCR和WB證明JAML在成年小鼠灌流

11、干凈的腎臟、脾臟、心臟、小腸、肺中均有表達(dá);Real-time RT-PCR及WB檢測小鼠腎臟中JAML表達(dá)。結(jié)果顯示，JAML的mRNA水平與蛋白水平與假手術(shù)組相比顯著上升，這一結(jié)果在IHC中也得到驗證。
　　1.2 JAML主要表達(dá)在腎近曲小管中
　　IF檢測發(fā)現(xiàn)，JAML主要表達(dá)在近曲小管中，外髓質(zhì)遠(yuǎn)曲小管也有表達(dá)，髓質(zhì)集合管中的表達(dá)較弱。
　　1.3體外模型條件下JAML的蛋白水平顯著升高
　　采用三種方

12、法OGD、AA-2DG、CoCl2處理HK-2細(xì)胞，JAML的蛋白水平均顯著升高。用缺氧處理的HK-2上清液培養(yǎng)巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞中JAML蛋白水平同樣升高。
　　2.JAML在腎缺血再灌注損傷中具有促進(jìn)損傷的作用
　　缺血再灌注后，JAML-/-小鼠血清中肌酐和尿素氮低于野生型小鼠，腎臟損傷減輕，腎臟中浸潤巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥因子表達(dá)下降，凋亡細(xì)胞減少。說明JAML的缺失減輕了腎缺血再灌注損傷。
　　

13、3.JAML調(diào)控Clec4e參與的體外缺血再灌注腎損傷
　　通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)Clec4e和其家族個別成員在缺血再灌注損傷后表達(dá)明顯上調(diào)，JAML缺失可明顯恢復(fù)損傷所誘導(dǎo)的這些基因的表達(dá)。Real-time RTPCR證實了這一結(jié)果。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與巨噬細(xì)胞相比，Clec4e在HK-2細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)量低，AA/2-DG刺激后誘導(dǎo)其表達(dá)升高，說明Clec4e參與了缺氧缺糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。
　　結(jié)論與創(chuàng)新性

14、r>　　1.首次對JAML在急性腎損傷中的表達(dá)變化進(jìn)行表征:腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中JAML的表達(dá)顯著升高，且這一結(jié)果也在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中得到證實。
　　2.首次證明JAML促進(jìn)了腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。因此，下調(diào)JAML的表達(dá)可抑制腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展和減輕炎癥反應(yīng)。
　　3.初步探討了JAML促進(jìn)腎缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，證明其對下游模式識別受體Clec4e的正調(diào)控作用。
　　綜上所述，