Hes-1介導(dǎo)VEGF促進OPN表達在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機制研究.pdf

1、目的：
　　動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心血管疾病的最關(guān)鍵致病因素。新生血管形成是粥樣硬化斑塊特征之一，它可以引發(fā)易損斑塊的發(fā)展，增加斑塊破裂的風(fēng)險。但是，血管新生發(fā)生及發(fā)展的調(diào)控機制直至今日未明確。
　　DNA結(jié)合蛋白(hairy enhancer of split,Hes-1)是一類DNA結(jié)合蛋白，因其結(jié)構(gòu)中含有α螺旋-環(huán)-螺旋(αHLH)而極具特征性。這一物質(zhì)可結(jié)合在特定分化效應(yīng)基因的啟動子上，從而發(fā)揮介導(dǎo)細胞分化的抑制信號，并

2、參與血管細胞發(fā)育、分化以及及新生血管形成等重要生理過程。Hes-1的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄在心血管以及平滑肌細胞的分化、血管的形成、動靜脈血管細胞的凋亡以及血管成形的過程中起到至關(guān)重要的作用。目前的一些研究已表明，Hes-1涉及了調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞(EC)的增殖、分化和凋亡的過程。但是，直至今日，關(guān)于HES-1是否參與到不穩(wěn)定斑塊中血管生成的過程中仍不清楚。
　　骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種分泌型糖基化磷蛋白，存在于細胞外基質(zhì)中，

3、其作用是參與介導(dǎo)細胞的黏附、增殖以及遷移，對于調(diào)節(jié)血管重構(gòu)起重要作用。初步研究表明，OPN不僅促進動脈粥樣硬化，還促進了新生血管的生成。在內(nèi)皮發(fā)生損傷后，平滑肌細胞出現(xiàn)一系列去分化、遷移、增殖的過程，在這些過程中OPN通過介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)的相互作用進而發(fā)揮了促進血管重塑的作用。雖然OPN調(diào)控機制在血管生成過程中仍不清楚，有研究顯示Hes-1過表達抑制成骨細胞OPN轉(zhuǎn)錄，這表明Hes-1可能是OPN潛在調(diào)節(jié)因子。在動脈粥樣硬化斑

4、塊中，內(nèi)皮細胞以及炎性細胞可以分泌產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，其可作為始動因子參與是斑塊以及血管生成，與此同時Hes-1也參與了VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。除了hes-1，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)VEGF誘導(dǎo)OPN的表達。然而，Hes-1是否通過調(diào)節(jié)OPN進而影響VEGF誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化斑塊中新生血管生成尚未闡明。本課題研究擬通過分別檢測Hes-1和OPN在動脈粥樣硬化組織中的表達情況，進而分析這兩種物質(zhì)的表達與相關(guān)病理參數(shù)之間的內(nèi)在聯(lián)系，與

5、此同時通過進行體外模型的實驗，研究并揭示Hes-1和OPN在AS疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中的所發(fā)揮的作用和分子學(xué)相關(guān)機制。
　　方法：
　　1.通過使用組織基因芯片來分析Hes-1和OPN為粥樣硬化動脈組織對比正常動脈組織標(biāo)本中的差異性表達基因;
　　2.熒光定量qPCR、免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光(immunofluorescence)檢測粥樣硬化動脈組織與正常動脈組織樣本中Hes-1和OPN的表達，并分析其的表達

6、量、定位;
　　3.通過體外VEGF刺激的方法，利用免疫印跡試驗(Western blot)檢測Hes-1和OPN表達情況;
　　4.構(gòu)筑建造Hes-1過表達型的載體，并使用合成siRNA對Hes-1的表達進行干擾，對臍靜脈內(nèi)皮細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染，利用western blot方法檢測Hes-1對OPN的調(diào)控作用;
　　5.構(gòu)建OPN過表達載體，合成siRNA干擾OPN的表達，通過基質(zhì)膠成管實驗檢測VEGF-Hes-1-O

7、PN對血管生成的影響。
　　結(jié)果：
　　基因芯片、RT-PCR以及IHC檢測的結(jié)果顯示：在動脈粥樣硬化斑塊的樣本中，Hes-1的表達水平顯著性降低，但是OPN的表達卻明顯增強。同時，免疫熒光結(jié)果顯示，HES-1和OPN均在斑塊中新生血管的內(nèi)皮中表達。體外細胞實驗表明，在VEGF的刺激下，臍靜脈內(nèi)皮細胞中Hes-1呈時間及劑量依賴性降低，OPN呈時間及劑量依賴性升高。將HES-1基因表達進行敲低處理后，可以增強OPN的表達以及