軸突導(dǎo)向分子Sema7A參與小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的初步研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是引發(fā)心血管疾病的主要原因。近年來(lái)，動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是一種系統(tǒng)性免疫炎癥的疾病，先天性免疫與獲得性免疫均參與其。損傷早期形態(tài)學(xué)變化即脂質(zhì)條紋，是一種嚴(yán)重的代謝和免疫損傷，表現(xiàn)為血管張力異常，炎癥，細(xì)胞和內(nèi)皮功能障礙。隨后損傷形成斑塊繼續(xù)生長(zhǎng)，最終凸入管腔或發(fā)生破裂。當(dāng)脂質(zhì)斑塊破裂后，形成的動(dòng)脈血栓會(huì)導(dǎo)致急性冠脈綜合征（ACS）、心肌梗死或腦中風(fēng)等惡性臨床事件，對(duì)人類的健康危害極大。但其發(fā)病機(jī)制目前仍不是十分清楚，尋找有效藥

2、物對(duì)該疾病的治療迫在眉睫。
　　Semaphrin家族是最初以參與軸突導(dǎo)向發(fā)現(xiàn)的一類蛋白分子家族，該類蛋白與組織器官的形成，血管生成與免疫細(xì)胞調(diào)控密切相關(guān)。Semaphrin家族包括20多個(gè)成員共分成8個(gè)亞類，Semaphrin7A（Sema7A）是跨膜的糖基化磷脂酰基醇蛋白，屬于第七類軸突導(dǎo)向分子家族，Sema7A能夠與β1整合素結(jié)合從而介導(dǎo)嗅覺神經(jīng)的生長(zhǎng)[1]并啟動(dòng)激活由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Sema7A蛋白可以通過(guò)與α1β1

3、結(jié)合刺激巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生諸如IL-8, IL-6, IL-1β以及TNF-α等炎癥因子。近期另有多篇研究發(fā)現(xiàn)，Sema7A在肝纖維化，神經(jīng)損傷，肺纖維化，皮膚炎癥，角膜炎癥和多種硬化癥中均有發(fā)揮促炎作用。
　　盡管目前我們得知Sema7A參與多種生理性過(guò)程及病理性疾病中，但Sema7A是否參與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生尚無(wú)報(bào)道。Sema7A及其受體在T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞以及血小板中均有表達(dá)，而這些細(xì)胞恰恰是與動(dòng)脈粥樣

4、硬化的發(fā)生有著密切關(guān)系的細(xì)胞種類。且有文獻(xiàn)證明內(nèi)皮細(xì)胞上的Sema7A可以誘導(dǎo)缺氧過(guò)程中中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮下層的遷移浸潤(rùn)過(guò)程，這也提示 Sema7A或在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中也可以介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向內(nèi)膜下層的遷移浸潤(rùn)。因此我們著手研究Sema7A在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的作用，并發(fā)現(xiàn)Sema7A敲除的情況下可以減少載脂蛋白E敲除小鼠的斑塊形成并減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　目的：
　　本文旨在探討軸突導(dǎo)向分子 Sema7A是否能夠影響動(dòng)脈

5、粥樣硬化脂質(zhì)斑塊形成，最終影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　研究方法：
　　1.利用ApoE-/-小鼠喂食高脂飼料1周，4周，12周，通過(guò)RNA以及蛋白水平檢測(cè)Sema7A及受體在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)情況。
　　2.制備Sema7A-/-ApoE-/-雙敲除小鼠。
　　3.通過(guò)對(duì)載脂蛋白E（ApoE）敲除小鼠（以下簡(jiǎn)寫為ApoE-/-小鼠）喂食高脂飼料（high-fat diet，以下簡(jiǎn)寫為HFD），建立動(dòng)脈

6、粥樣硬化小鼠模型。
　　4. Sema7A-/-ApoE-/-雙敲除小鼠與Sema7A+/+ApoE-/-單敲除小鼠,，在喂食高脂飼料12周前后的體重對(duì)比，檢測(cè)Sema7A存在與否對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的體重產(chǎn)生影響。并通過(guò)眼眶后靜脈叢抽取高脂血癥小鼠的靜脈血，分離血清，檢測(cè)比較Sema7A-/-ApoE-/-雙敲除小鼠與Sema7A+/+ ApoE-/-單敲除小鼠血漿中的血脂含量，分析Sema7A對(duì)高脂血癥狀態(tài)下小鼠血脂含量的影響。

7、
　　5.當(dāng)喂食HFD12周后，ApoE-/-小鼠能夠形成穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，鈍性分離得到小鼠整只主動(dòng)脈，通過(guò)蘇丹紅染色，對(duì)比Sema7A-/-ApoE-/-雙敲除小鼠與Sema7A+/+ApoE-/-單敲除小鼠斑塊的分布與大小，研究Sema7A是否影響ApoE-/-小鼠冠狀及胸主動(dòng)脈中脂質(zhì)斑塊的形成。并通過(guò)對(duì)比兩組小鼠斑塊內(nèi)細(xì)胞種類以及分布的不同，研究Sema7A存在與對(duì)斑塊內(nèi)細(xì)胞成分的影響。
　　6.取形成穩(wěn)定斑塊的

8、小鼠的主動(dòng)脈組織，通過(guò)提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄并通過(guò)定量PCR方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞活化亞型的相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而分析巨噬細(xì)胞的極化情況。
　　7.動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建成功后，分離全血血清，比較 Sema7A-/- ApoE-/-雙敲除小鼠與Sema7A+/+ ApoE-/-單敲除小鼠血漿中T細(xì)胞活化分泌的細(xì)胞因子的水平以及炎癥因子的水平，檢測(cè)Sema7A對(duì)高脂血癥狀態(tài)下小鼠炎癥因子含量的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在喂食H

9、FD期間，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)Sema7A的表達(dá)呈規(guī)律變化。與喂食普通飼料相比，喂食HFD可以明顯上調(diào)主動(dòng)脈組織中Sema7A的表達(dá)，并且在喂食一周時(shí)Sema7A的表達(dá)量達(dá)到最高。
　　2.成功制備了Sema7A-/-ApoE-/-雙敲除小鼠。
　　3.小鼠在喂食12周 HFD后其冠狀及胸主動(dòng)脈中產(chǎn)生了大量脂質(zhì)斑塊，Sema7A-/- ApoE-/-雙敲除小鼠斑塊大小較 Sema7A+/+ ApoE-/-單敲除小鼠降低

10、了51.18％(Sema7A-/-ApoE-/-:5.01±1.04%, Sema7A+/+ApoE-/-:10.26±1.15%, P=0.0024)。
　　4.動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型建立后，與 Sema7A+/+ ApoE-/-單敲除小鼠相比，Sema7A-/-ApoE-/-雙敲除小鼠的斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞以及免疫細(xì)胞T細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞的含量有比較明顯的降低。
　　5.通過(guò)主動(dòng)脈根部斑塊切片染色發(fā)現(xiàn)，與ApoE-/-Sema7A

11、+/+單敲除小鼠相比，ApoE-/- Sema7A-/-雙敲除小鼠的斑塊內(nèi)膠原含量明顯上調(diào)(Sema7A-/- ApoE-/-:88.37±0.75%;Sema7A+/+ApoE-/-:82.00±1.38%, P<0.0022),-/-+/+，且斑塊的易破損系數(shù)明顯降低，斑塊的穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)。
　　6.動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型建立后，與-Sema7A+/+ ApoE-/-單敲除小鼠相比，Sema7A-/-ApoE-/-雙敲除小鼠主動(dòng)

12、脈組織中1型巨噬細(xì)胞M1有明顯的降低，2型巨噬細(xì)胞的含量有一定的升高趨勢(shì)。
　　7.通過(guò)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血漿中血脂含量以及免疫細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，相較于單敲小鼠，雙敲除小鼠的炎癥因子的水平明顯降低且血漿中促炎T細(xì)胞表達(dá)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　我們闡明了Sema7A通過(guò)影響高脂血癥狀態(tài)下小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞以及免疫細(xì)胞的數(shù)量以及免疫應(yīng)答進(jìn)而影響到主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊的形成，從而抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的