免疫穩(wěn)態(tài)分子TIPE2在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究新型免疫穩(wěn)態(tài)分子TIPE2在從胃炎到胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能，并試圖解析TIPE2抑制胃上皮細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，從而為胃部疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供新的線(xiàn)索。
　　 方法:
　　 1.組織水平上，以免疫組織化學(xué)方法檢查胃炎胃癌組織中TIPE2蛋白表達(dá)情況。同時(shí)提取組織RNA，通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)mRNA水平上TIPE2的表達(dá)，以及與細(xì)胞增殖相關(guān)的分子N-ras，p21CIP1/WAF1，p53，p27，B

2、cl-2等的表達(dá)情況;
　　 2.細(xì)胞水平上，采用人TIPE2高表達(dá)質(zhì)粒pRK5-tipe2轉(zhuǎn)染胃上皮細(xì)胞系，在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)TIPE2，檢測(cè)TIPE2在胃上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移中的作用:
　　 (1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將TIPE2高表達(dá)質(zhì)粒pRK5-tipe2及其對(duì)照質(zhì)粒pRK5-mock轉(zhuǎn)染胃上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS和BGC-823，分別于48小時(shí)、72小時(shí)后收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白。通過(guò)qRT-PCR和Westernblottin

3、g在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)TIPE2的表達(dá)，并評(píng)估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率。
　　 (2)細(xì)胞增殖能力檢測(cè):不同濃度梯度的TIPE2表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染AGS和BGC-823細(xì)胞系，于48小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔300個(gè)細(xì)胞的比例加入六孔板中，培養(yǎng)至形成肉眼可見(jiàn)的克隆，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的差異。
　　 (3)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測(cè):培養(yǎng)高表達(dá)TIPE2的AGS和BGC-823細(xì)胞，以藍(lán)色無(wú)菌槍頭劃線(xiàn)，顯微觀察劃線(xiàn)區(qū)域細(xì)胞生長(zhǎng)

4、情況;
　　 3.研究TIPE2對(duì)細(xì)胞周期的影響:TIPE2表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染AGS和BGC-823細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，以流式細(xì)胞術(shù)(FCS)分析這些細(xì)胞所處周期的變化;
　　 4.生物芯片分析TIPE2抑制細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制:AGS細(xì)胞在轉(zhuǎn)染TIPE2高表達(dá)質(zhì)粒后，進(jìn)行表達(dá)譜生物芯片分析，并以qRT-PCR和Westernblotting方法對(duì)變化顯著的靶基因及其通路相關(guān)分子在mRNA和蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)

5、證。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組化結(jié)果顯示TIPE2在胃部的正常組織有高表達(dá)，但在胃部慢性炎癥組織中表達(dá)降低，在胃癌組織中無(wú)表達(dá);qRT-PCR從mRNA水平驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果，證明在胃部疾病發(fā)生發(fā)展時(shí)TIPE2表達(dá)確實(shí)發(fā)生變化;
　　 2.胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染TIPE2表達(dá)質(zhì)粒后，在蛋白水平上TIPE2表達(dá)量顯著升高;同時(shí)能夠檢測(cè)到細(xì)胞克隆形成能力明顯受到抑制，但在傷口愈合實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差別不大，表明TI

6、PE2對(duì)胃上皮細(xì)胞增殖抑制作用大，而對(duì)胃上皮細(xì)胞遷移能力的作用效果小。
　　 3.FCS結(jié)果顯示TIPE2的過(guò)量表達(dá)能夠抑制S期細(xì)胞的比例，使細(xì)胞停留在G1期，表明TIPE2通過(guò)抑制細(xì)胞進(jìn)入S期從而抑制胃上皮細(xì)胞的增殖。
　　 4.生物芯片分析以及蛋白分析的結(jié)果表明，TIPE2高表達(dá)引發(fā)細(xì)胞增殖相關(guān)的分子N-ras，p21CIP1/WAF1，p27，p53和CDK2表達(dá)升高，抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)。