炎癥微環(huán)境在炎癥性結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用及機(jī)制解析.pdf

1、背景：慢性炎癥是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)力。潰瘍性結(jié)腸炎是慢性炎癥性腸病的一種主要形式。與正常人群相比，潰瘍性結(jié)腸炎病人結(jié)腸癌發(fā)生率明顯增高，并且與其炎癥病變的范圍、持續(xù)時(shí)間以及病變程度密切相關(guān)。免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，炎性因子，趨化因子及其受體，基質(zhì)金屬蛋白酶等構(gòu)成的炎癥微環(huán)境對(duì)炎癥性結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展起到了關(guān)鍵作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TANs)經(jīng)CXCR2-CXCL2趨化軸介導(dǎo)，向結(jié)腸炎癥部位聚集，促進(jìn)炎癥性腸癌的發(fā)生

2、和發(fā)展。同時(shí)，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在建立的小鼠炎癥性腸癌模型中，結(jié)腸部位有大量的成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)。據(jù)相關(guān)報(bào)道顯示，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞作為腫瘤基質(zhì)的主要成分對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到非常重要的作用，而其在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制還不十分清楚。
　　目的：1.建立小鼠炎癥性結(jié)腸癌(CAC)模型，后期給予中性粒細(xì)胞表面抗原Ly6G抗體干預(yù)，通過(guò)阻斷中性粒細(xì)胞向病變結(jié)腸組織聚集，拮抗炎癥性腸癌的發(fā)展，進(jìn)一步驗(yàn)證腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TANs)在CAC發(fā)生

3、和發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用。2.探討腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，闡明FGF1/3-FGFR4信號(hào)通路在結(jié)直腸癌形成過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　方法：1.建立AOM/DSS動(dòng)物模型，在模型建立第56天，隨機(jī)分為兩組，一組連續(xù)7天尾靜脈注射抗中性粒細(xì)胞表面抗原抗體Ly6G即治療組，另一組連續(xù)7天尾靜脈注射對(duì)照IgG抗體（對(duì)照組）。第0、56、67天行乙醚麻醉，脫臼安樂(lè)處死小鼠，取結(jié)直腸組織保存?zhèn)溆?。qRT-PCR法

4、檢測(cè)治療前后CXCL2、CXCR2、MMP-9以及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶NE的mRNA水平的變化;用HE染色法檢測(cè)治療前后結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)變化;用免疫熒光染色方法檢測(cè)治療前后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的變化、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶NE蛋白水平的變化;用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)治療前后CXCL2、CXCR2、CD31、PCNA、MMP-9蛋白水平的變化。2.用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)CAC模型0、14、28、35、56天時(shí)成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

5、的動(dòng)態(tài)變化，血管形成指標(biāo)MMP-7蛋白水平的變化;qRT-PCR法檢測(cè)各階段細(xì)胞因子和趨化因子mRNA水平的變化，Western-blot檢測(cè)各個(gè)階段增殖相關(guān)指標(biāo)p-Erk，Erk蛋白水平的變化。3.體外實(shí)驗(yàn)選取結(jié)腸癌病人的正常組織、癌旁組織、癌組織體外分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，qRT-PCR法檢測(cè)三種細(xì)胞表達(dá)的生長(zhǎng)因子FGF等mRNA水平的變化;將其上清與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)，Western-Blot檢測(cè)Mek/Erk、MMP-7的變化;使用受

6、體FGFR4抑制劑和FGF重組蛋白處理結(jié)腸癌細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)上述相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)變化;CCK8及小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞CAFs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果：1.第67天處死小鼠后，與對(duì)照組相比較，抗體治療組肉眼可見(jiàn)腫瘤減少(p＜0.01);HE染色鏡下可見(jiàn)，注射Ly6G抗體后，結(jié)腸腫瘤的組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。2.與對(duì)照組相比，治療組結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少(p＜0.01)、CXCL

7、2，CXCL5和CXCR2的表達(dá)明顯降低(p＜0.05)，而且MMP-9表達(dá)顯著降低(p＜0.01)，新生血管明顯減少(p＜0.01); NE表達(dá)也明顯減少(p＜0.01)，細(xì)胞增殖活性顯著下降(p＜0.01)。這些結(jié)果提示使用抗中性粒細(xì)胞表面抗原抗體可以逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的發(fā)展。3.在小鼠CAC模型中，成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯增強(qiáng)，炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α在結(jié)腸癌形成過(guò)程中表達(dá)增加(p＜0.05)

8、，此外，CXCL-2及PDGF-α的表達(dá)也明顯增加(p＜0.01)。血管形成指標(biāo)MMP-7(p＜0.01)、增殖相關(guān)信號(hào)分子p-Erk、Erk表達(dá)也顯著增加。4.體外提取成纖維細(xì)胞純度達(dá)90％以上，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞CAFs高表達(dá)FGF1和FGF3(p＜0.05)。將成纖維細(xì)胞的上清與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)，與NFs，PFs相比，CAFs可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并且與CAFs細(xì)胞上清共培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞FGFR4自身磷酸化水平(p-Tyrosi

9、ne)、p-Mek/Erk、MMP-7的表達(dá)上調(diào)，而總FGFR4的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。將成纖維細(xì)胞上清與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，CCK8和小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CAFs細(xì)胞上清共培養(yǎng)，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。5.在含有CAFs上清培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中加入FGFR4抑制劑后，p-Tyrosine，p-Mek、p-Erk、MMP-7水平明顯減少。6.在結(jié)腸癌細(xì)胞中加入重組蛋白FGF-1和FGF-3，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p-