LIM激酶1亞細(xì)胞定位在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本課題擬檢測LIMK-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，研究LIMK-1在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用和相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.組織基因芯片分析LIMK-1為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中的差異表達(dá)基因;
　　2.免疫組織化學(xué)(IHC)、免疫印跡(western blot)和免疫熒光(immunofluorescence)檢測

2、結(jié)直腸癌石蠟樣本和新鮮組織樣本中LIMK-1的表達(dá)，并分析LIMK-1的表達(dá)定位與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后等相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系;
　　3.引入核定位、核輸出信號(hào)，構(gòu)建LIMK-1胞漿、胞核亞細(xì)胞定位表達(dá)載體，合成siRNA干擾LIMK-1的表達(dá)，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株，在體外利用CCK8、transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)等分別檢測瞬時(shí)過表達(dá)及干擾LIMK-1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響;
　　4.建立LIMK-1胞

3、漿、胞核亞細(xì)胞定位穩(wěn)定過表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，在體外通過CCK8、transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖及遷移能力;在體內(nèi)通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的生長能力，裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的肺定植能力;
　　5.利用western blot檢測LIMK-1瞬時(shí)過表達(dá)后信號(hào)通路的激活情況、EMT標(biāo)志物表達(dá)的變化;
　　6.利用帶HA抗體的Agroase篩選LIMK1相互作用的蛋白，質(zhì)譜鑒定差異條帶，利用免疫共沉淀技術(shù)(Co-im

4、munoprecipitation)及免疫熒光驗(yàn)證候選蛋白與LIMK-1的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.LIMK-1在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)水平的檢測
　　1)基因芯片分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌LIMK-1的表達(dá)
　　2)結(jié)直腸癌組織中LIMK-1的表達(dá)
　　組織免疫熒光結(jié)果顯示LIMK-1蛋白在正常組織中的表達(dá)水平較低，主要表達(dá)于組織的細(xì)胞漿;在癌組織中表達(dá)水平較高，主要表達(dá)于細(xì)胞漿與細(xì)胞

5、核中。
　　3)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中LIMK-1在的表達(dá)
　　免疫熒光結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)移潛能相對(duì)低的HCT116、LS174T、SW480和HT29細(xì)胞系中表達(dá)相對(duì)較低，主要定位于細(xì)胞漿，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來源的LOVO、SW620細(xì)胞系中表達(dá)相對(duì)較高，陽性定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核。
　　4)LIMK-1的表達(dá)和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
　　LIMK-1的表達(dá)水平與年齡組、性別腫瘤大小和腫瘤分化沒有顯著差異; LIMK-1的表達(dá)

6、與結(jié)直腸癌TNM分期相關(guān)，其中隨著結(jié)直腸癌細(xì)胞浸潤深度(T)增加LIMK-1的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，但隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)發(fā)生，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1+N2)胞漿內(nèi)LIMK-1過表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0)胞漿內(nèi)過表達(dá)率(P=0.007)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1+N2)胞核內(nèi)LIMK-1過表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0組)胞核內(nèi)過表達(dá)率(P=0.000)，并且隨著遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)發(fā)生，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(M1)胞漿內(nèi)LIMK-1過表達(dá)率高于

7、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(M0)胞漿內(nèi)過表達(dá)率(P=0.029)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（M1組）胞核內(nèi)LIMK-1過表達(dá)率高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(M0)胞核內(nèi)過表達(dá)率(P＜0.05);復(fù)發(fā)組LIMK-1胞漿過表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)組胞漿內(nèi)過表達(dá)率(P=0.049)，復(fù)發(fā)組LIMK-1胞核過表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)組胞核內(nèi)過表達(dá)率。
　　5)LIMK-1的表達(dá)水平與患者臨床預(yù)后的相關(guān)分析
　　Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果顯示，LIMK-1胞漿、胞核內(nèi)過表達(dá)的

8、結(jié)直腸癌患者總體生存率顯著低于低表達(dá)組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異;LIMK-1胞漿、胞核內(nèi)過表達(dá)的T3+T4和N0分期結(jié)直腸癌患者的總體生存率顯著低于低表達(dá)組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。
　　2.LIMK-1的不同亞細(xì)胞定位對(duì)結(jié)直腸癌生物學(xué)特性的影響
　　1)LIMK-1瞬時(shí)過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響
　?、貺IMK-1瞬時(shí)過表達(dá)效果驗(yàn)證
　　我們引入核定位、核輸出信號(hào)，合成構(gòu)建了LIMK-1胞漿、胞核亞細(xì)胞定位表

9、達(dá)載體（及空白對(duì)照組載體(HA)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)源性低表達(dá)LIMK-1的SW480、HCT116細(xì)胞，westernblot檢測HA-LIMK1融合蛋白表達(dá)。
　?、贚IMK-1瞬時(shí)過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SW480和HCT116細(xì)胞中，瞬時(shí)過表達(dá)LIMK-1的細(xì)胞(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1)與對(duì)照組(HA)相比的生長速度顯著上升，組別和時(shí)間存在

10、交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、跮IMK-1瞬時(shí)過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SW480和HCT116細(xì)胞中，瞬時(shí)過表達(dá)LIMK-1的細(xì)胞株與對(duì)照組(HA)相比遷移細(xì)胞的數(shù)量明顯增多(P=0.000);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瞬時(shí)過表達(dá)LIMK-1的細(xì)胞株與對(duì)照組(HA)相比遷移率明顯增加(P=0.000)。
　　2)LIMK-1瞬時(shí)沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

11、
　　①LIMK-1瞬時(shí)沉默效率驗(yàn)證
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染siRNA-377，siRNA-391兩個(gè)干擾片段的細(xì)胞LIMK-1蛋白的表達(dá)水平明顯下降，表明該兩個(gè)干擾片段可以成功敲低LIMK-1的表達(dá)。
　　②LIMK-1瞬時(shí)沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響
　　結(jié)果:在SW620細(xì)胞中，LIMK-1干擾組的生長速度顯著慢于對(duì)照組(NC)，組別與時(shí)間存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　③LIMK-1瞬時(shí)沉默對(duì)結(jié)

12、直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　結(jié)果:在SW620細(xì)胞中，LIMK-1瞬時(shí)干擾組遷移細(xì)胞的數(shù)量顯著少于對(duì)照組(NC)(P=0.001)。
　　3)LIMK-1穩(wěn)定過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響
　?、俜€(wěn)定過表達(dá)LIMK-1細(xì)胞株SW480的構(gòu)建與鑒定
　　免疫熒光檢測結(jié)果顯示SW480/HA-LIMK1的外源性LIMK-1定位于細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)，SW480/HA-NLS-LIMK1的外源性LIMK1定位于細(xì)胞

13、核內(nèi)，SW480/HA-NES-LIMK1的外源性LIMK-1定位于細(xì)胞漿內(nèi)。
　?、贚IMK-1穩(wěn)定過表達(dá)體外實(shí)驗(yàn)
　　CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（SW480/HA）相比穩(wěn)定過表達(dá)LIMK-1的細(xì)胞株生長速度顯著上升，組別和時(shí)間存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.904，P＜0.001);Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穩(wěn)定過表達(dá)LIMK-1的細(xì)胞株與對(duì)照組(SW480/HA)相比遷移細(xì)胞的數(shù)量明顯增多

14、(P=0.000)。
　?、跮IMK-1穩(wěn)定過表達(dá)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比穩(wěn)定過表達(dá)LIMK-1的細(xì)胞株腫瘤生長速度較快，腫瘤重量較重(P=0.005)，體積較大(P=0.017)，同時(shí)，Ki67的陽性率(80.97％、74.08％、80.61％)顯著高于對(duì)照組SW480/HA(39.54％)(p=0.000);裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)定過表達(dá)LIMK-1的細(xì)胞株與對(duì)照組(SW480/HA)

15、相比腫瘤細(xì)胞肺定植能力明顯增強(qiáng)，肺臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增多(p=0.009)。
　　3.LIMK-1調(diào)控結(jié)直腸癌增殖轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　1) LIMK-1過表達(dá)后AKT信號(hào)通路蛋白p-PTEN、p-AKT(473)、p-AKT(308)和AKT表達(dá)的影響
　　結(jié)果:SW480和HCT116細(xì)胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個(gè)處理組p-PTEN的表達(dá)較HA對(duì)照組表達(dá)低，HA-LIMK

16、1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個(gè)處理組p-AKT(473)、p-AKT(308)的表達(dá)較HA對(duì)照組高，AKT總蛋白量在4種處理細(xì)胞間無顯著差異。
　　2)LIMK-1過表達(dá)后對(duì)CRC細(xì)胞EMT相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的影響
　　結(jié)果:SW480和HCT116細(xì)胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個(gè)處理組上皮標(biāo)志物(E-cadherin、β-catenin)的表達(dá)較HA對(duì)

17、照組表達(dá)量低;HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個(gè)處理組間葉標(biāo)志物(N-cadherin、Fibronectin)的表達(dá)較HA對(duì)照組表達(dá)量高。
　　3)LIMK-1與MYH9、ACTN4的直接結(jié)合檢測
　　結(jié)果:LIMK-1與MYH9、ACTN4存在直接結(jié)合。
　　4)LIMK-1與MYH9、ACTN4的共定位檢測
　　結(jié)果:LIMK-1與ACTN4、MYH9存在共定位。