LIM激酶1亞細胞定位在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機制研究.pdf

1、目的:
　　本課題擬檢測LIMK-1在結(jié)直腸癌中的表達情況，分析其表達與相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;通過體內(nèi)外實驗，研究LIMK-1在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用和相關(guān)的分子機制。
　　方法:
　　1.組織基因芯片分析LIMK-1為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中的差異表達基因;
　　2.免疫組織化學(xué)(IHC)、免疫印跡(western blot)和免疫熒光(immunofluorescence)檢測

2、結(jié)直腸癌石蠟樣本和新鮮組織樣本中LIMK-1的表達，并分析LIMK-1的表達定位與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后等相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系;
　　3.引入核定位、核輸出信號，構(gòu)建LIMK-1胞漿、胞核亞細胞定位表達載體，合成siRNA干擾LIMK-1的表達，通過瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞株，在體外利用CCK8、transwell、劃痕實驗等分別檢測瞬時過表達及干擾LIMK-1對結(jié)直腸癌細胞增殖及遷移能力的影響;
　　4.建立LIMK-1胞

3、漿、胞核亞細胞定位穩(wěn)定過表達的結(jié)直腸癌細胞株，在體外通過CCK8、transwell實驗檢測細胞的增殖及遷移能力;在體內(nèi)通過裸鼠皮下成瘤實驗檢測細胞的生長能力，裸鼠尾靜脈注射實驗檢測細胞的肺定植能力;
　　5.利用western blot檢測LIMK-1瞬時過表達后信號通路的激活情況、EMT標志物表達的變化;
　　6.利用帶HA抗體的Agroase篩選LIMK1相互作用的蛋白，質(zhì)譜鑒定差異條帶，利用免疫共沉淀技術(shù)(Co-im

4、munoprecipitation)及免疫熒光驗證候選蛋白與LIMK-1的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.LIMK-1在結(jié)直腸癌組織及細胞中表達水平的檢測
　　1)基因芯片分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌LIMK-1的表達
　　2)結(jié)直腸癌組織中LIMK-1的表達
　　組織免疫熒光結(jié)果顯示LIMK-1蛋白在正常組織中的表達水平較低，主要表達于組織的細胞漿;在癌組織中表達水平較高，主要表達于細胞漿與細胞

5、核中。
　　3)結(jié)直腸癌細胞系中LIMK-1在的表達
　　免疫熒光結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)移潛能相對低的HCT116、LS174T、SW480和HT29細胞系中表達相對較低，主要定位于細胞漿，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶來源的LOVO、SW620細胞系中表達相對較高，陽性定位于細胞漿及細胞核。
　　4)LIMK-1的表達和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
　　LIMK-1的表達水平與年齡組、性別腫瘤大小和腫瘤分化沒有顯著差異; LIMK-1的表達

6、與結(jié)直腸癌TNM分期相關(guān)，其中隨著結(jié)直腸癌細胞浸潤深度(T)增加LIMK-1的表達無顯著差異(P＞0.05)，但隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)發(fā)生，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1+N2)胞漿內(nèi)LIMK-1過表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0)胞漿內(nèi)過表達率(P=0.007)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1+N2)胞核內(nèi)LIMK-1過表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N0組)胞核內(nèi)過表達率(P=0.000)，并且隨著遠處轉(zhuǎn)移(M)發(fā)生，遠處轉(zhuǎn)移組(M1)胞漿內(nèi)LIMK-1過表達率高于

7、無遠處轉(zhuǎn)移組(M0)胞漿內(nèi)過表達率(P=0.029)，遠處轉(zhuǎn)移組（M1組）胞核內(nèi)LIMK-1過表達率高于無遠處轉(zhuǎn)移組(M0)胞核內(nèi)過表達率(P＜0.05);復(fù)發(fā)組LIMK-1胞漿過表達率高于未復(fù)發(fā)組胞漿內(nèi)過表達率(P=0.049)，復(fù)發(fā)組LIMK-1胞核過表達率高于未復(fù)發(fā)組胞核內(nèi)過表達率。
　　5)LIMK-1的表達水平與患者臨床預(yù)后的相關(guān)分析
　　Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果顯示，LIMK-1胞漿、胞核內(nèi)過表達的

8、結(jié)直腸癌患者總體生存率顯著低于低表達組，統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異;LIMK-1胞漿、胞核內(nèi)過表達的T3+T4和N0分期結(jié)直腸癌患者的總體生存率顯著低于低表達組，統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。
　　2.LIMK-1的不同亞細胞定位對結(jié)直腸癌生物學(xué)特性的影響
　　1)LIMK-1瞬時過表達對結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲的影響
　?、貺IMK-1瞬時過表達效果驗證
　　我們引入核定位、核輸出信號，合成構(gòu)建了LIMK-1胞漿、胞核亞細胞定位表

9、達載體（及空白對照組載體(HA)，瞬時轉(zhuǎn)染內(nèi)源性低表達LIMK-1的SW480、HCT116細胞，westernblot檢測HA-LIMK1融合蛋白表達。
　　②LIMK-1瞬時過表達對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響
　　CCK8實驗結(jié)果顯示，在SW480和HCT116細胞中，瞬時過表達LIMK-1的細胞(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1)與對照組(HA)相比的生長速度顯著上升，組別和時間存在

10、交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、跮IMK-1瞬時過表達對結(jié)直腸癌細胞遷移能力的影響
　　Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，在SW480和HCT116細胞中，瞬時過表達LIMK-1的細胞株與對照組(HA)相比遷移細胞的數(shù)量明顯增多(P=0.000);劃痕實驗結(jié)果顯示，瞬時過表達LIMK-1的細胞株與對照組(HA)相比遷移率明顯增加(P=0.000)。
　　2)LIMK-1瞬時沉默對結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲的影響

11、
　?、貺IMK-1瞬時沉默效率驗證
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染siRNA-377，siRNA-391兩個干擾片段的細胞LIMK-1蛋白的表達水平明顯下降，表明該兩個干擾片段可以成功敲低LIMK-1的表達。
　?、贚IMK-1瞬時沉默對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響
　　結(jié)果:在SW620細胞中，LIMK-1干擾組的生長速度顯著慢于對照組(NC)，組別與時間存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、跮IMK-1瞬時沉默對結(jié)

12、直腸癌細胞遷移能力的影響
　　結(jié)果:在SW620細胞中，LIMK-1瞬時干擾組遷移細胞的數(shù)量顯著少于對照組(NC)(P=0.001)。
　　3)LIMK-1穩(wěn)定過表達對結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲的影響
　?、俜€(wěn)定過表達LIMK-1細胞株SW480的構(gòu)建與鑒定
　　免疫熒光檢測結(jié)果顯示SW480/HA-LIMK1的外源性LIMK-1定位于細胞漿與細胞核內(nèi)，SW480/HA-NLS-LIMK1的外源性LIMK1定位于細胞

13、核內(nèi)，SW480/HA-NES-LIMK1的外源性LIMK-1定位于細胞漿內(nèi)。
　?、贚IMK-1穩(wěn)定過表達體外實驗
　　CCK8實驗結(jié)果顯示，與對照組（SW480/HA）相比穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株生長速度顯著上升，組別和時間存在交互效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.904，P＜0.001);Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株與對照組(SW480/HA)相比遷移細胞的數(shù)量明顯增多

14、(P=0.000)。
　?、跮IMK-1穩(wěn)定過表達體內(nèi)實驗
　　裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示，與對照組相比穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株腫瘤生長速度較快，腫瘤重量較重(P=0.005)，體積較大(P=0.017)，同時，Ki67的陽性率(80.97％、74.08％、80.61％)顯著高于對照組SW480/HA(39.54％)(p=0.000);裸鼠尾靜脈注射實驗結(jié)果表明，穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株與對照組(SW480/HA)

15、相比腫瘤細胞肺定植能力明顯增強，肺臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增多(p=0.009)。
　　3.LIMK-1調(diào)控結(jié)直腸癌增殖轉(zhuǎn)移的分子機制
　　1) LIMK-1過表達后AKT信號通路蛋白p-PTEN、p-AKT(473)、p-AKT(308)和AKT表達的影響
　　結(jié)果:SW480和HCT116細胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個處理組p-PTEN的表達較HA對照組表達低，HA-LIMK

16、1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個處理組p-AKT(473)、p-AKT(308)的表達較HA對照組高，AKT總蛋白量在4種處理細胞間無顯著差異。
　　2)LIMK-1過表達后對CRC細胞EMT相關(guān)分子標志物表達的影響
　　結(jié)果:SW480和HCT116細胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個處理組上皮標志物(E-cadherin、β-catenin)的表達較HA對

17、照組表達量低;HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個處理組間葉標志物(N-cadherin、Fibronectin)的表達較HA對照組表達量高。
　　3)LIMK-1與MYH9、ACTN4的直接結(jié)合檢測
　　結(jié)果:LIMK-1與MYH9、ACTN4存在直接結(jié)合。
　　4)LIMK-1與MYH9、ACTN4的共定位檢測
　　結(jié)果:LIMK-1與ACTN4、MYH9存在共定位。