PPM1D在結直腸癌增殖中的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　構建人PPM1D基因的RNA干擾慢病毒載體，測定病毒滴度。檢測結腸癌細胞RKO在基因沉默后的細胞生物學變化及差異性基因的表達情況，以探索PPM1D基因在結腸癌細胞惡性增殖中的作用及其機制。
　　方法：
　　檢索針對PPM1D的siRNA序列，參考Sigma網(wǎng)站公布的資源，選取一條siRNA序列，同時參考文獻挑選一條通用siRNA陰性對照序列;兩端加上酶切位點，合成雙鏈DNA oligo，成為含干擾序列的具對

2、應粘性末端的shRNA表達框架。將shRNA表達框架插入pFH-L慢病毒骨架質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，陽性克隆行PCR鑒定，構建含有針對PPM1D的shRNA病毒骨架質(zhì)粒。
　　用shPPM1D或者對照組的短發(fā)卡RNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染239T細胞，同時也轉(zhuǎn)染兩個幫助質(zhì)粒，分別是pCMVAR8.92和pVSVG-(I)，這兩個質(zhì)粒編碼慢病毒組裝蛋白。應用Lipofectamin2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染后48小時，收

3、集包含組裝慢病毒的培養(yǎng)基，使用0.45μm的濾紙進行濃縮。病毒滴度確定和校準后，慢病毒溶液儲存于-80℃。
　　慢病毒感染，RKO細胞中加入組裝的慢病毒，在37℃，5％CO2中培養(yǎng)至少3天。轉(zhuǎn)染后收獲RKO細胞，按照廠家說明書應用Trizol提取RNA。應用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 PPM1D的表達水平使用TB200應用熒光定量混合物性實時PCR進行評價。PPM1D的引物為PPM1D5'-CTACAC

4、CACCAGTCAAGTCAC3'前向）and5'-AGAAGGCATTGCTACGAACC-3'（反向）。PBS沖洗后，收集RKO細胞，使用RIPA緩沖液進行裂解。RIPA緩沖液的組成:20 mM Tris-HCl(pH7.5),150 mM NaCl,1 mM Na2EDTA,1 mM EGTA,1％ NP-40,1％脫氧膽酸鈉，2.5 mM焦磷酸鈉，1 mMβ甘油磷酸鹽，1 mM Na3VO4，1μg/ml亮抑酶肽。SDS-PAG

5、E分離蛋白標本，轉(zhuǎn)移，與一抗4℃孵育過夜。室溫下二抗孵育1小時后，使用增強化學發(fā)光(Amersham)進行觀察。
　　慢病毒感染后3天，RKO細胞懸液接種于96孔板，最初的濃度為每孔2000細胞。然后每孔加入20μl5 mg/ml的MTT。細胞孵育3小時后，每孔加入100μl的酸化異丙醇(0.01 M HCl)。甲瓚沉淀物溶解后，在595nm光波長度下應用酶標儀讀板。
　　慢病毒感染后3天，RKO細胞懸液接種于6孔板，最初的

6、濃度為每孔1200細胞。當每個單克隆包含50個細胞以上時，捕獲影像。然后，標本使用4％福爾馬林固定并根據(jù)說明書進行Giemsa染色，并攝影。
　　慢病毒感染后3天，收集RKO細胞，冷PBS重懸，然后4℃下用預冷的75％乙醇進行固定30分鐘。PBS沖洗后，4℃下與含有RNA酶和碘化丙啶的PBS暗室孵育過夜。流式細胞儀分析標本，數(shù)據(jù)使用多周期AV軟件進行分析。
　　結果：
　　GFP熒光證明，慢病毒的轉(zhuǎn)染率很高，實驗組和對

7、照組類似。使用RT-PCR，我們測量了PPM1D的mRNA水平。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了Lv-shPPM1D后，與未轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒者，其表達水平下降了60％左右。蛋白水平使用Western印跡法進行評價。我們發(fā)現(xiàn)Lv-shPPM1D可以顯著降低內(nèi)源性PPM1D的蛋白水平。
　　為研究結直腸癌細胞中PPM1D沉默的效應，檢測了增殖和群落形成能力。Lv-shPPM1D感染后，增殖率與非感染或?qū)φ战M的增殖率下降了。然后分析了RKO細胞的群落

8、形成能力。PPM1D沉默可以顯著減少RKO細胞的群落形成能力。使用Giemsa染色，我們發(fā)現(xiàn)單個群落中細胞數(shù)目顯著減少。上述證據(jù)提示內(nèi)源性PPM1D的表達減少可以顯著抑制結直腸癌的生長。
　　為研究是否PPM1D敲除誘導細胞生長抑制是否是由于細胞周期的調(diào)節(jié)失調(diào)，行流式細胞儀檢測。Lv-shPPM1D感染誘導RKO細胞集中在細胞周期的G0/G1期。在Lv-shPPM1D感染組，45.87±0.64％的RKO細胞在細胞周期的G0/G1

9、期，這比非感染組(38.67±0.93％)和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(42.60±0.95％)顯著升高。在PPM1D沉默組，44.00％±0.17％的RKO細胞處于細胞周期的S期，這比非感染組(52.20±0.62％)和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(48.50±1.25％)顯著降低。我們進一步分析了處于亞G1期的細胞比例。PPM1D敲除后，5.98±0.35％的細胞處于細胞周期的亞G1期，這比非感染組(1.47±0.11％)和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（1.70±0.08

10、％）顯著升高。這些結果提示敲除PPM1D后誘導細胞聚集于亞G1期，導致細胞增殖和群落形成受抑制。
　　為進一步研究PPM1D沉默誘導腫瘤細胞生長抑制的機制，我們分析了細胞生長相關信號分子的表達水平。CyclinB1和CyclinD1是細胞周期控制中的調(diào)節(jié)性蛋白。我們發(fā)現(xiàn)敲除PPM1D導致CyclinB1的下調(diào)，而不影響CyclinD1的表達水平。由于細胞增殖中ERK信號傳導系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用，而PPM1D依賴于ERK活化，我們評價

11、了PPM1D敲除后ERK的活化。我們發(fā)現(xiàn)結直腸癌細胞中抑制PPM1D的表達后，磷酸化的ERK減少了。而且，由于AKT磷酸化也與細胞增殖有關，我們檢測了AKT通路的活化。我們發(fā)現(xiàn)Lv-shPPM1D敲除PPM1D后，磷酸化AKT的數(shù)目顯著增加。上訴這些證據(jù)說明應用慢病毒介導的RNA沉默抑制PPM1D表達，可以通過抑制CyclinB1/ERK通路抑制結直腸癌的細胞增殖。
　　結論：
　　RNA干擾技術是廣泛應用的是目標基因沉默的

12、技術，它作用于mRNA水平，而且慢病毒可以使干擾RNA有效的傳遞到目標細胞。
　　Lv-shPPM1D可以有效的減少內(nèi)源性的PPM1D表達，從而抑制結直腸RKO細胞的細胞增殖和群落形成。PPM1D敲除可以導致細胞周期停滯在G0/G1相，細胞聚集在亞G1期，從而導致細胞生長抑制。
　　PPM1D敲除可以誘導CyclinB1和磷酸化-ERK的下調(diào)，而不影響CyclinD1的表達。PPM1D敲除可以促進AKT磷酸化，提示PI3K/