ACY-1在結直腸癌中的表達及作用機制.pdf

1、背景
　　結直腸癌為目前世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其在消化道惡性腫瘤發(fā)病率中僅次于胃癌和食道癌。在我國，結直腸癌的發(fā)病率在近二十年來呈逐漸上升趨勢，且發(fā)病人群的年齡逐漸趨于年輕化。隨著我國居民的飲食結構以及生活方式的改變，結直腸癌的發(fā)病率在城市居民中增高尤其明顯。結直腸癌具有高發(fā)病率、高死亡率以及高轉移率的特點，因此對人類生命健康構成了巨大威脅。盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術水平的不斷發(fā)展和完善，在對結直腸癌的治療上已經取得了突破性進展

2、，但結直腸癌患者生存率依然未得到明顯改善。結直腸癌患者的生存率與其診斷時所處的惡性化程度之間存在相關性，即Ⅰ期結直腸癌患者的五年生存率可高達93％，而Ⅲ期結直腸癌患者的5年生存率則僅為8％。引起結直腸癌患者死亡的大部分原因是由于腫瘤復發(fā)轉移，目前臨床上通過手術為主的綜合治療方法僅能夠使約50％的結直腸癌患者在術后三年內無進展生存，但約有大于40％的結直腸癌患者在術后發(fā)生復發(fā)和轉移，而且結直腸癌復發(fā)的高峰期往往集中在術后2年左右。因此，尋

3、找與結直腸癌發(fā)生以及惡性化進程相關的分子標志物，同時對其相關功能及作用機制進行深入探索是目前醫(yī)學界研究的重點和熱點內容，對于結直腸癌患者的早期檢測、治療以及預后情況判斷具有十分重要的意義。
　　結直腸癌的惡性化過程通常是由體內外多種因素參與的多步驟的復雜過程，通過網絡性調控影響結直腸癌的生物學行為。隨著腫瘤分子生物學探索的不斷深入，越來越多的基因被證實參與了結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程。氨基?；?（aminoacylase-1，AC

4、Y-1）為一種胞質酶，能夠使細胞內蛋白的N末端肽鏈上的α酰化氨基酸發(fā)生乙?；诖诉^程之后能夠使該蛋白質的穩(wěn)定性增強。當機體內的原癌基因活化或者抑癌基因失活時，細胞的生長以及分化過程將發(fā)生失控，從而向癌細胞轉變。目前對于ACY-1的研究大部分集中在其具有的酰化氨基酸水解酶的活性作用方面，臨床上通常將血清ACY-1作為判斷腎移植預后的指標，但依然缺少其在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中作用的研究。目前已有研究表明，ACY-1在多種實體惡性腫瘤組織

5、中的表達量發(fā)生下調，從而提示ACY-1可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。還有報道發(fā)現(xiàn)，ACY-1在神經母細胞瘤患者的血清中呈低表達狀態(tài)時往往預示著患者的預后情況較差。但目前尚未有對于ACY-1在結直腸癌中表達以及作用機制的報道。
　　轉化生長因子β(TGF-β)為一個在人體多種生理病理過程具有生物學功能的生長因子超家族，主要功能是調控細胞增殖以及分化過程，同時還在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。除此之外，TGF-β還具有促進細胞外基質的形成

6、以及調控機體免疫反應等功能。TGF-β共包括6種異構體(TGF-β1～6)，其中TGF-β1最為常見，幾乎參與了生物機體內所有的病理以及生理過程，與臨床上多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、胚胎發(fā)育、細胞外基質的形成以及免疫調節(jié)過程中均扮演著十分重要的角色。目前已有研究證實，TGF-β1在乳腺癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌、宮頸癌以及膀胱癌等惡性腫瘤組織中呈異常高表達狀態(tài)，且其表達水平與上述腫瘤的進展以

7、及轉移相關。
　　細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)家族的重要成員之一。MAPK通路能夠被多種因素刺激而活化，其中包括細胞因子、神經遞質、生長因子、激素、細胞應激以及細胞黏附等，其下游靶基因包括多種蛋白激酶、磷脂酶和轉錄因子等。當這些下游靶基因被活化之后能夠直接使核轉錄因子以及其他

8、蛋白激酶等底物發(fā)生磷酸化，從而對相關基因的轉錄過程進行調控，最終影響機體細胞的生長、發(fā)育、分裂，從而維持其正常生理功能的完整性。ERK1和ERK2是MAPK/ERK信號轉導通路中的兩個重要成員，主要對細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等生理過程進行調控，同時在細胞的惡性轉化過程中亦扮演著重要角色。由ERK所介導的信號轉導通路受到來自于細胞內外多種絲裂原的刺激和應激，從而使ERK的底物活化，最終實現(xiàn)調控細胞周期以及抑制細胞凋亡的作用，同時還能夠促

9、進細胞增殖、遷移以及侵襲等生理病理過程。ERK1/2在生物機體細胞內分布產生變化往往預示著MAPK信號轉導通路的功能狀態(tài)發(fā)生改變。研究表明，在未受到刺激的細胞中，ERK1/2大部分均存在于細胞質中;當細胞受到刺激時，部分ERK1/2向細胞核中聚集，從而形成p-ERK1/2。p-ERK1/2能夠與細胞核內的多種轉錄因子發(fā)生相互作用，從而促進了癌基因的表達。ERK1/2信號通路與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在顯著相關性。
　　目的
　

10、　本研究通過檢測ACY-1在結直腸癌組織中的表達，明確其臨床意義，同時對其在結直腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲以及轉移過程中的相關作用機制進行研究，旨在探討ACY-1與結直腸癌發(fā)生和發(fā)展的相關性，從而為尋找新的腫瘤分子標志物以及藥物作用靶點奠定基礎。
　　方法
　　(1)采集132例結直腸組織樣本均來自于山東大學附屬省立醫(yī)院胃腸外科2015年6月～2016年6月結直腸癌手術切除組織樣本，按照性別進行劃分，其中男性為70例，女性為6

11、2例;按照年齡進行劃分，其中≤50歲為57例，＞50歲為75例;按照是否淋巴結轉移進行劃分，其中發(fā)生轉移的為52例，未發(fā)生轉移的為80例;TNM分期進行劃分，其中Ⅰ期為44例、Ⅱ期為62例、Ⅲ期+Ⅳ為26例。另外選取120例健康志愿者血清作為對照組。采集上述入選者的癌組織、相應癌旁正常組織或血清，分別運用熒光定量PCR、western blot法以及ELISA法檢測ACY-1 mRNA及其蛋白的表達，并分析其與患者性別、年齡、TNM分期

12、和淋巴結轉移的相關性。
　　(2)將攜帶有siRNA-ACY-1基因的慢病毒載體GV218-EGFP-ACY-1轉染人293T細胞，待包裝出病毒之后將之感染人結腸癌HT29細胞，以此構建ACY-1過抑制表達HT29細胞系。用倒置熒光顯微鏡對人293T細胞的轉染效率進行觀察。熒光定量PCR檢測ACY-1表達抑制的HT29細胞中ACY-1 mRNA的表達;運用Transwell小室法檢測該細胞系的侵襲能力;流式細胞術測定細胞的凋亡情況

13、，CCK-8法檢測細胞的增殖活性。
　　(3)分別將siRNA-NC和siRNA-ACY-1轉染HT-29細胞，運用western blot法分別檢測ACY-1抑制表達的人結腸癌細胞HT29細胞中p-ERK1/2和TGF-β1蛋白的表達。
　　結果
　　(1)熒光定量PCR檢測表明，ACY-1 mRNA在癌旁相應正常組織（對照組）中的表達量為0.324±0.012，在結直腸癌組織中的表達量為0.614±0.051，顯著

14、高于對照組（P＜0.05）。western blot檢測結果表明，ACY-1蛋白在癌旁相應正常組織中的表達量為0.231±0.065，在結直腸癌組織中的表達量為0.646±0.038，顯著高于對照組(P＜0.05)。ELISA檢測結果表明，癌旁正常組織中ACY-1的含量為36.88±5.65 pg/mL，結直腸癌患者血清中的含量為57.11±6.32 pg/mL，明顯高于健康志愿者(P＜0.05)。對ACY-1的表達與結直腸癌患者臨床病

15、例參數(shù)的相關性進行分析，結果表明ACY-1的表達與結直腸癌患者的性別和年齡之間無顯著相關性（P＞0.05），而與TNM分期和是否發(fā)生淋巴結轉移有關(P＜0.05)。
　　(2)熒光定量PCR檢測結果表明，構建的ACY-1抑制表達HT29細胞中的ACY-1 mRNA的表達量明顯低于對照組，表明成功構建ACY-1抑制表達HT29細胞系。CCK-8檢測結果表明，轉染siRNA-ACY-1后細胞的增殖活性明顯低于對照組（P＜0.01）。流

16、式細胞術檢測結果表明，ACY-1抑制表達的HT29細胞的凋亡細胞數(shù)量顯著高于對照組(P＜0.01)。Transwell檢測結果表明，感染siRNA-ACY-1后HT29細胞的侵襲能力顯著低于對照組（P＜0.05）。
　　(3)western blot法檢測結果表明，對照組ACY-1蛋白的相對表達量為0.78±0.11，siRNA-ACY-1組為0.16士0.04。與對照組相比，siRNA-ACY-1組ACY-1蛋白的表達量明顯低于

17、對照組（P＜0.01）。對照組p-ERK1/2蛋白的相對表達量為0.89±0.13，TGF-β1蛋白為0.78±0.14; siRNA-ACY-1組p-ERK1/2蛋白的相對表達量為0.33±0.09，TGF-β1蛋白為0.21±0.06。與對照組相比，p-ERK1/2、TGF-β1蛋白的表達量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論
　　ACY-1在結直腸癌組織中呈高表達，且其表達量與結直腸癌患者的TNM