LRG1在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其調(diào)控機制研究.pdf

1、本文對LRG1在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其調(diào)控機制進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：LRG1在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床意義。
　　目的：研究LRG1在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達水平，探討LRG1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達與哪些臨床病理因素相關(guān)。
　　方法：利用公共數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)分析 LRG1在結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜中的表達情況。收集30對新鮮結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本，通過Real-t

2、ime PCR檢測組織標(biāo)本中LRG1 mRNA的表達水平。免疫組化實驗評估68例結(jié)直腸癌組織和32例正常腸黏膜組織的石蠟標(biāo)本中LRG1蛋白的表達情況，分析68例結(jié)直腸癌組織中LRG1的陽性表達與患者臨床病理因素之間有無相關(guān)性。
　　結(jié)果：⑴選擇Oncomine數(shù)據(jù)庫中的兩個芯片數(shù)據(jù)集 GSE20916和GSE20842，芯片數(shù)據(jù)分析顯示 LRG1在結(jié)直腸癌組織中的表達量顯著高于正常組織。⑵Real-time PCR結(jié)果顯示LRG1

3、在30對新鮮結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于配對的正常組織（P<0.0001）。⑶免疫組化實驗發(fā)現(xiàn) LRG1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性率為66.18％（45/68），在正常組織中的陽性率為31.25%（12/32），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007）。LRG1的表達與結(jié)直腸癌的T分期和N分期具有相關(guān)性，T3/T4期結(jié)直腸癌組織中LRG1表達陽性率顯著高于T1/T2期結(jié)直腸癌(P=0.032)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的LRG1表達陽性率顯著

4、高于淋巴結(jié)陰性的患者(P=0.013)。
　　結(jié)論：LRG1在結(jié)直腸癌中的表達水平顯著高于正常腸黏膜組織，且與結(jié)直腸癌的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)。因此推測，LRG1可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，尤其是侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分：LRG1對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　目的：研究LRG1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的作用，以及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型的作用。探討 LRG1刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞對其VEGF-

5、A表達水平的影響，以及結(jié)直腸癌細(xì)胞來源條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：將LRG1 siRNA和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染到兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞系 HCT116和 SW480后，通過 Real-time PCR和 Western blot驗證LRG1 siRNA的干擾效率。劃痕實驗和 Transwell侵襲實驗分別檢測轉(zhuǎn)染LRG1 siRNA后HCT116和SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力。利用 Real-time PC

6、R和 Western blot檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志物（E-cadherin，VDR），間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（N-cadherin，Vimentin,α-SMA）和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Twist1）的表達水平，評估敲除 LRG1對結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型的作用。不同濃度和時間梯度的人重組 LRG1蛋白刺激 HCT116和 SW480細(xì)胞后，Real-time PCR檢測細(xì)胞中VEGF-A mRNA的表達水平，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中 VEG

7、F-A蛋白的含量。收集經(jīng)人重組 LRG1蛋白刺激 HCT116細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移實驗和小管形成實驗，評估不同處理組腫瘤細(xì)胞來源條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力和小管形成能力的影響。
　　結(jié)果：⑴LRG1 siRNA能夠顯著下調(diào) HCT116和 SW480細(xì)胞中LRG1 mRNA和蛋白的表達水平。劃痕實驗中，LRG1 siRNA干擾組細(xì)胞的傷口愈合速度明顯比陰性對照組慢。LRG1 siRNA干擾組穿過 Mat

8、rigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯減少。⑵Real-time PCR和 Western blot結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞中干擾 LRG1導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-cadherin和 VDR的表達明顯上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 N-cadherin，Vimentin,α-SMA和轉(zhuǎn)錄因子 Twist1的表達均明顯下調(diào)。⑶人重組LRG1蛋白刺激 HCT116和 SW480細(xì)胞后，VEGF-A mRNA和蛋白分泌水平均出現(xiàn)上調(diào)，且具有時間和濃度依賴性。LRG1刺

9、激HCT116細(xì)胞后的條件培養(yǎng)基能使內(nèi)皮細(xì)胞遷移速度明顯加快，小管形成數(shù)量顯著增多。
　　結(jié)論：干擾LRG1基因能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化過程。LRG1刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞能顯著上調(diào) VEGF-A mRNA的表達和蛋白的分泌，影響腫瘤局部的血管生成。
　　第三部分：LRG1促進結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究。
　　目的：LRG1促進結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲和腫瘤血管生成的作用機制尚不明確。

10、本部分將探索 LRG1的下游基因和參與的信號通路。驗證LRG1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT和過表達VEGF-A是否依賴于HIF-1α。
　　方法：利用人基因表達譜芯片技術(shù)篩選 SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染 LRG1 siRNA和陰性對照 siRNA組下游差異表達的基因，對數(shù)據(jù)進行分析后最終選定HIF-1α。為進一步驗證LRG1和HIF-1α的關(guān)系，我們用不同濃度的人重組 LRG1蛋白刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞后，分別用 Real-time PCR和We

11、stern blot檢測HIF-1α mRNA和蛋白表達水平。預(yù)先干擾 HIF-1α的表達后，再加入 LRG1刺激 SW480細(xì)胞，用 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF-A的分泌水平，Western blot檢測HIF-1α、VEGF-A、N-cadherin、E-cadherin和 Twist1的表達量，Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果：基因芯片檢測結(jié)果顯示LRG1與多條腫瘤相關(guān)的通路有關(guān)聯(lián)。LRG1刺