NDRG1對結(jié)直腸癌干性的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、背景和目的：
　　眾多研究報道，N-Myc下游調(diào)控基因1（NDRG1）在不同腫瘤類型，如結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC），前列腺癌，胰腺癌中起到抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NDRG1表達能明顯促進CRC細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT），從而增加腫瘤細胞的遷移侵襲能力。眾多研究表明，發(fā)生EMT的腫瘤細胞可能會表現(xiàn)出不同程度的干細胞樣特征。然而NDRG1是否能抑制CRC細胞的干性尚未見

2、文獻明確報道。因此，本研究以該問題為出發(fā)點，探討NDRG1對CRC干性的影響，并探討其可能的發(fā)生機制。
　　研究方法：
　　1.利用以往成功構(gòu)建并篩選的穩(wěn)定過表達NDRG1基因及穩(wěn)定沉默NDRG1基因的CRC細胞株HCT116和HT29為細胞模型。運用上述細胞克隆，我們首先在體外實驗中(in vitro)探究了NDRG1過表達及基因沉默對CRC細胞體外一系列“干細胞樣”表型的影響，包括一代、二代無血清成球能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力、

3、克隆形成能力和化療耐藥性等。將HT29細胞進行梯度稀釋后，種植于裸鼠體內(nèi)（in vivo），觀察不同NDRG1表達的HT29細胞在體內(nèi)致瘤性的差別。
　　2.體外用流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測NDRG1過表達或沉默對CRC細胞表面干性分子 CD44、CD133表達的影響；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（Reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測不同NDRG1表達對細胞內(nèi)其它干性轉(zhuǎn)錄分子

4、（如OCT4，NANOG，SOX2，ALDH1）mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。
　　3.免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence，IF）觀察NDRG1表達對β-catenin在細胞中定位的影響；抽提不同細胞組分蛋白（全蛋白、核蛋白、膜蛋白），WesternBlot檢測NDRG1對不同細胞組分中β-catenin表達的影響，并檢測β-catenin下游蛋白c-myc和cyclin D1的表達水平；TOP/FOP Flash assa

5、y技術(shù)檢測β-catenin轉(zhuǎn)錄活性變化，用以反映NDRG1對Wnt信號通路活性的影響。
　　4.為研究NDRG1是否通過β-catenin抑制CRC細胞的干性，我們在NDRG1穩(wěn)定下調(diào)的細胞（sh NDRG1）和對照細胞（sh Con）中干擾下調(diào)β-catenin，并在體外實驗中觀察下調(diào)β-catenin表達后能否逆轉(zhuǎn)NDRG1低表達造成的干性增強的表型。
　　5.研究 NDRG1在臨床 CRC組織和相應正常組織間的表達的

6、差異；分析NDRG1表達與 CRC臨床病理資料指標的關(guān)系；在組織水平研究 NDRG1、β-catenin和干性分子CD44是否具有共同定位表達關(guān)系，分析其表達的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.在NDRG1過表達的CRC細胞HCT116和HT29中，上述干細胞樣表型（無血清成球能力；轉(zhuǎn)移侵襲能力；克隆形成能力；化療抗性）均受到不同程度的抑制，而在穩(wěn)定下調(diào) NDRG1的細胞中，這些干性特征獲得明顯增強。NDRG1過表達明顯抑制

7、HT29細胞在裸鼠體內(nèi)的有限稀釋致瘤能力，表現(xiàn)為瘤體出現(xiàn)晚、出現(xiàn)比率低；瘤體生長慢、重量輕。
　　2. NDRG1顯著下調(diào)CRC干性標志物CD44的表達，下調(diào)NDRG1明顯增強CD44分子在膜上的表達，而 NDRG1對干性分子 CD133的表達無明顯影響。NDRG1過表達抑制OCT4和NANOG的轉(zhuǎn)錄，而下調(diào)NDRG1卻顯著增強SOX2的轉(zhuǎn)錄，NDRG1表達變化對ALDH1的轉(zhuǎn)錄無明顯影響。
　　3. NDRG1過表達能明顯

8、促進β-catenin在細胞膜上的分布并抑制其細胞核轉(zhuǎn)位，進而抑制其轉(zhuǎn)錄活性及下游靶蛋白c-myc和cyclin D1的表達，而下調(diào)NDRG1卻表現(xiàn)出相反的特點。
　　4.在下調(diào)NDRG1的細胞（sh NDRG1）及對照細胞（sh Con）中同時干擾下調(diào)β-catenin（shβ-catenin）的表達后，β-catenin轉(zhuǎn)錄活性明顯降低而且靶蛋白表達減少，細胞原有的干性特征得到逆轉(zhuǎn)；而轉(zhuǎn)染shβ-catenin Con的細胞與

9、先前未轉(zhuǎn)染細胞相比，干性表型無明顯變化。
　　5. NDRG1在正常結(jié)直腸粘膜上皮中的表達顯著強于在腫瘤組織中的表達；NDRG1表達陽性CRC患者的術(shù)后五年生存率明顯高于NDRG1表達陰性的病例。而且，NDRG1表達陽性的CRC組織多伴有核β-catenin和膜CD44的陰性表達；NDRG1表達陰性的CRC病例多伴有核β-catenin和膜CD44的強陽性表達。
　　結(jié)論和意義：
　　本研究從體外體內(nèi)兩方面證明了NDR