DIXDC1對結直腸癌發(fā)展的影響機制以及與其相關microRNA的研究.pdf

1、前言:
　　DIXDC1是新近克隆的人類Wnt通路的新基因,即ccd1基因(Coiled-coil-DIX1)人類的異構體,ccd1基因在斑馬魚神經管發(fā)育過程中被證實是一個Wnt通路的正調控因子。25％左右的人微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability)MSI-H的結直腸癌中檢測到Wnt通路重要組分Axin2基因突變。上述突變集中于外顯子7上的4個單核苷酸連續(xù)序列,導致移碼和Axin2蛋白C-末端(包括D

2、IX結構域)的缺失,提示Axin2蛋白的C-末端可能參與抑制結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展,然而機制不甚清楚。DIXDC1蛋白就是以Axin2的C-末端為誘餌,通過酵母雙雜交實驗,篩選出的與Axin2C-末端存在相互作用的一個蛋白。
　　目前DIXDC1基因全長己經成功地被克隆并制備了相應的抗體,但關于DIXDC1生物化學及細胞生物學的研究報道較少。有研究顯示DIXDC1屬于actin和tubulin結合蛋白家族的新成員,提示其可能參與對細

3、胞形態(tài)和運動的調節(jié)。
　　DIXDC1作為Wnt通路的新成員分子,其具體功能怎樣,如何通過Wnt通路對于結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展進行調節(jié);其本身是否受到Wnt通路的調節(jié),其調節(jié)方式如何;microRNA是否也參與調控DIXDC1的表達,與其相關的miRNA與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展關系如何,目前未見國內外報道。本課題從研究DIXDC1的功能為切入點,將首次闡明其在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學作用及機制;并進一步探討Wnt通路對DIXDC1

4、蛋白表達水平的影響及機制;利用miRNA芯片及生物信息數(shù)據(jù)庫篩選出與DIXDC1存在相互作用的miRNA,進一步驗證相關miRNA對DIXDC1表達的調控并探討相關miRNA對結直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。為結直腸癌發(fā)生發(fā)展機制研究提供新的實驗依據(jù),為臨床結直腸癌的診斷和治療提供一定的理論基礎。
　　第一部分:DIXDC1對大腸癌細胞生物學特性的影響及機制研究
　　目的:闡明DIXDC1對大腸癌細胞生物學特性的影響并進一步深入研究

5、其機制。
　　方法:脂質體介導的穩(wěn)定轉染方法建立DIXDC1過表達的DLD1細胞;MTT法和裸鼠成瘤實驗檢測細胞增殖能力;免疫組織化學方法檢測DIXDC1在結直腸癌組織中的表達情況及其與增殖指數(shù)(Ki-67)的相關性;流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡情況;Western blot檢測細胞周期相關蛋白表達水平和PI3K、MAPK信號通路激活狀態(tài);雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測DIXDC1對TCF/LEF轉錄活性的影響;免疫共沉淀技術驗證DI

6、XDC1與Phospho-AKT之間的相互作用;采用PI3K信號通路抑制劑LY294002處理,觀察其對DIXDC1過表達細胞生長情況、細胞周期及周期相關蛋白表達的影響;轉染DIXDC1siRNA干擾DIXDC1表達后,觀察其對DIXDC1過表達細胞生長情況、細胞周期及周期相關蛋白表達和PI3K信號通路的影響。
　　結果:DIXDC1的過表達于體外水平促進大腸癌細胞的增殖,于體內水平促進裸鼠移植瘤形成及生長。與正常腸粘膜相比,結直

7、腸癌組織中DIXDC1蛋白表達水平升高,并且與增殖指數(shù)Ki-67的表達具有密切的相關性。DIXDC1通過上調cyclinD1、下調p21蛋白表達進而促進細胞周期G0/G1到S期的轉化,且激活PI3K信號通路。同時DIXDC1可以上調β-catenin蛋白表達,并且具有增強TCF/LEF轉錄活性的作用。通過PI3K信號通路抑制劑作用或者干擾DIXDC1蛋白的表達后,β-catenin和cyclinD1蛋白表達下調而p21蛋白表達升高,同時

8、阻滯了細胞周期G0/G1到S期的轉化。
　　結論:DIXDC1具有促進大腸癌細胞增殖和腫瘤形成的作用,其過表達后可以通過上調cyclinD1和下調p21蛋白表達進而促進細胞周期G0/G1到S期的轉化,DIXDC1促大腸癌細胞增殖效應可能與PI3K信號通路的激活相關。
　　第二部分:Wnt通路對DIXDC1的調控及其機制研究
　　目的:闡明Wnt通路對DIXDC1蛋白表達的調控及其相關機制。
　　方法:免疫組織化學

9、方法檢測DIXDC1與β-catenin在結直腸癌中共表達及共定位情況;Real-timeRT-PCR檢測正常腸粘膜、結直腸癌組織及Wnt-3a刺激前后大腸癌細胞中DIXDC1mRNA表達水平的改變;Western blot檢測Wnt-3a刺激后大腸癌細胞中DIXDC1蛋白表達水平的改變;CHXchaseassay檢測DIXDC1蛋白的半衰期,并觀察Wnt-3a對DIXDC1蛋白穩(wěn)定性的影響;采用MG132處理細胞后應用Weaern b

10、lot檢測DIXDC1蛋白表達的改變;免疫沉淀技術檢測DIXDC1與泛素蛋白的結合情況,并觀察Wnt-3a對DIXDC1蛋白泛素化水平的影響:免疫共沉淀技術檢測Wnt-3a對DIXDC1蛋白磷酸化水平的影響。
　　結果:結直腸癌組織中DIXDC1與β-catenin存在共表達及共定位情況。與正常組織相比,結直腸癌組織中DIXDC1蛋白表達水平升高但mRNA表達水平卻下降。體外實驗中Wnt-3a可以誘導DIXDC1蛋白表達水平的升高

11、,但mRNA表達水平卻未見升高。Wnt-3a增加DIXDC1蛋白的穩(wěn)定性,蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞后,DIXDC1蛋白表達水平升高。Wnt-3a抑制了DIXDC1與泛素蛋白的結合從而增加了DIXDC1蛋白穩(wěn)定性,同時抑制了DIXDC1蛋白磷酸化水平。
　　結論:DIXDC1蛋白是通過蛋白酶體途徑降解的,經典Wnt通路的激活可以通過抑制其泛素化而增加DIXDC1蛋白的穩(wěn)定性;Wnt通路可能通過抑制DIXDC1蛋白的磷酸化水平

12、而影響其泛素化降解。
　　第三部分:與DIXDC1存在相互作用microRNA的篩選及其對結直腸癌發(fā)生發(fā)展影響的研究
　　目的:篩選并驗證與DIXDC1存在相互作用的miRNA,并闡明其對結直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　方法:首先通過一系列重復實驗對Agilent公司microRNA芯片的穩(wěn)定性和可靠性進行評估;芯片篩選正常腸粘膜、炎性息肉、腸腺瘤和結直腸癌中差異表達的miRNA;選取芯片檢測結果中差異表達的17個miR

13、NA,對14對樣本RNA進行Real-time RT-PCR檢測;運用Significance Analysis of Microarray(SAM)芯片數(shù)據(jù)分析技術對結直腸癌發(fā)生發(fā)展各階段中差異表達的miRNA進行分析;通過Target Scan 4.2數(shù)據(jù)庫預測,篩選與DIXDC1存在較為保守的相互作用,且芯片結果中變化較為顯著的miRNA;通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miRNA與DIXDC13’UTR區(qū)域的結合情況;miRNA寡核苷

14、酸轉染實驗和Western-blot實驗檢驗miRNA對DIXDC1蛋白表達水平的影響。通過Corrected t test:Bonferroni correction統(tǒng)計分析進一步探討與DIXDC1相關miRNA對結直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　結果:Agilent公司的microRNA芯片(chip)含有8個獨立的陣列(array),陣列內重復檢測探針的平均變異系數(shù)僅為6.3％,同一芯片內陣列之間的相關性到達0.999,不同芯片

15、之間的相關性也到達0.999,Real-timeRT-PCR檢測的17個miRNA的差異變化與芯片檢測結果的相關性到達0.90。經過SAM分析顯示,在正常腸粘膜-炎性息肉與腸腺瘤-結直腸癌中表達存在明顯差異的有63個miRNA,其中40個表達升高,23個表達下降;在腸腺瘤與結直腸癌中表達存在明顯差異的有38個miRNA,其中11個表達升高,27個表達下降。選擇下調表達最明顯的miR-195和miR-497進行深入研究,發(fā)現(xiàn)miR-195

16、和miR-497均能作用于DIXDC13’UTR,進而抑制DIXDC1mRNA的轉錄,且均可以抑制DIXDC1蛋白的表達。通過Corrected t test:Bonferroni correction統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)一部分miRNA只在從正常腸粘膜-炎性息肉到腸腺瘤病變過程中存在差異表達;另外一部分miRNA卻只在從腸腺瘤到結直腸癌(Dukes’A/B)的病變過程中存在差異表達;而還有一部分miRNA在腸癌發(fā)生發(fā)展的整個過程中均存在差異表

17、達,即從正常腸粘膜-炎性息肉到腸腺瘤到結直腸癌(Dukes’A/B),miR-195和miR-497在腸癌發(fā)生發(fā)展的整個過程中均存在差異表達,參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展的整個過程。
　　結論:在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中存在一系列差異表達的microRNA。miR-195和miR-497在腸腺瘤和結直腸癌組織中的表達均顯著下調,且與DIXDC1存在相互作用,參與DIXDC1蛋白表達的調節(jié),我們認為DIXDC1、miR-195和miR-4