羥氯喹對腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的防治作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　炎癥性腸病(IBD)患者，包括克羅恩氏病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者，較健康人群更易發(fā)生腸癌，由IBD發(fā)展而來的腸癌稱為腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(CAC)。IBD患者腸上皮屏障破損，腸道微生物進(jìn)入腸粘膜固有層，激活固有免疫細(xì)胞Toll樣受體(TLRs)炎性通路，如巨噬細(xì)胞TLR4炎性通路，釋放大量促炎因子和DNA突變誘導(dǎo)劑活性氧(ROS)，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞惡性變，從而導(dǎo)致腸癌發(fā)生發(fā)展。腸道炎性微環(huán)境是CAC發(fā)生的重要誘因，

2、抑制腸道炎癥是防治CAC的重要手段。氯喹(CQ)及其衍生物羥氯喹(HCQ)除治療瘧疾外，也用于治療炎癥性疾病，如細(xì)菌感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。CQ/HCQ通過抑制胞內(nèi)細(xì)菌生長、促炎因子釋放、促炎信號(hào)通路活化發(fā)揮抗炎作用。此外，CQ/HCQ也能用于治療腫瘤，現(xiàn)有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明:CQ/HCQ通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，治療非小細(xì)胞肺癌、頭頸部腫瘤和轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤等。有研究發(fā)現(xiàn)CQ能有效緩解輕中度活動(dòng)性UC患者腸道炎癥，但是，

3、CQ/HCQ對IBD誘導(dǎo)而來CAC是否有防治作用未知，值得我們進(jìn)一步探討。
　　目的:
　　在小鼠致死性腸炎和CAC模型中，研究HCQ對腸炎和腸道腫瘤的療效，并對其抗炎和抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法:
　　1.用高劑量葡聚糖硫酸鈉(DSS)喂予小鼠建立致死性腸炎模型，HCQ持續(xù)每天給藥，觀察小鼠存活率。
　　2.用氧化偶氮甲烷(AOM)+DSS建立小鼠早期CAC模型，HCQ持續(xù)每天給藥，評估小鼠腸炎。

4、分離純化小鼠腸粘膜固有層免疫細(xì)胞，Western blot檢測炎性蛋白NF-κB、STAT3和MAPK表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測促炎因子IL1β、IL6、TNFα、COX2、IFNβ、IP10、RANTES和MCP1的mRNA水平，流式檢測ROS表達(dá)。
　　3.分析基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)微陣列數(shù)據(jù)，研究TLR4基因在IBD患者和健康人群表達(dá)變化。
　　4.體外TLR4配體脂多糖刺激巨噬細(xì)胞活化，檢測HCQ對TLR4信號(hào)通

5、路蛋白表達(dá)、促炎因子mRNA水平和ROS生成的作用。
　　5.用AOM+DSS建立小鼠中晚期CAC模型，HCQ持續(xù)每天給藥，觀察小鼠腸道腫瘤數(shù)目、直徑改變。分離純化小鼠腸粘膜固有層免疫細(xì)胞，Westernblot檢測炎性蛋白表達(dá)。分離純化小鼠腸道腫瘤細(xì)胞，免疫組化檢測細(xì)胞增殖蛋白Ki-67、凋亡蛋白c-PARP表達(dá)，Western blot檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、凋亡蛋白表達(dá)，免疫熒光染色分析小鼠結(jié)腸Tunel表達(dá)。
　　結(jié)果

6、:
　　1.HCQ顯著提高小鼠致死性腸炎存活率。
　　2.HCQ緩解小鼠CAC早期腸道炎癥，具體表現(xiàn)為緩解小鼠體重下降、結(jié)腸縮短，降低疾病活動(dòng)指數(shù)和組織形態(tài)學(xué)評分。HCQ抑制腸固有層免疫細(xì)胞炎性蛋白NK-κB、STAT3和MAPK磷酸化、促炎因子IL1β、IL6、TNFα、COX2、IFNβ、IP10、RANTES和MCP1表達(dá)、ROS釋放。
　　3.與健康人群相比，IBD患者腸道高表達(dá)TLR4基因。體外實(shí)驗(yàn)，HCQ抑

7、制巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路，具體表現(xiàn)為抑制TLR4通路相關(guān)蛋白活化，抑制促炎因子表達(dá)和ROS釋放。
　　4.HCQ抑制小鼠CAC中晚期腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展，具體表現(xiàn)為緩解小鼠體重下降，小鼠腸道腫瘤數(shù)目減少、直徑減小，降低小鼠腺癌比例。HCQ抑制腸固有層免疫細(xì)胞炎性蛋白NK-κB、STAT3和MAPK磷酸化。HCQ抑制腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)周期停滯和細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　本課題中，我們發(fā)現(xiàn)HCQ緩解小鼠CAC模型早期腸炎和

8、中晚期腫瘤發(fā)生發(fā)展。在小鼠CAC早期腸炎，HCQ抑制腸固有層免疫細(xì)胞炎性通路活化、促炎因子生成和DNA突變誘導(dǎo)劑ROS釋放。HCQ發(fā)揮抗炎作用可能部分是通過抑制巨噬細(xì)胞TLR4通路活化起作用的。因此，HCQ可以抑制腸炎，進(jìn)而抑制腸上皮細(xì)胞惡性變，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。此外，HCQ也能直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞。在小鼠中晚期CAC，HCQ能抑制腸道腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其周期停滯和凋亡?？傊?，HCQ通過抗炎和抗腫瘤雙重作用，對小鼠CAC起防治作用。臨床上，