Gankyrin促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子作用機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（CRC）是世界上第三大癌癥，致死率極高。約25％的病人被診斷時(shí)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，而另外約25%的患者在早期診斷中雖未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，但最終會(huì)發(fā)展為肝轉(zhuǎn)移。其發(fā)生肝轉(zhuǎn)移是死亡率高的一個(gè)重要原因，隨著對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移研究的深入，一些信號(hào)分子成為研發(fā)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移藥物的潛在靶標(biāo)。因此，深入研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)有效的調(diào)控分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)于藥物研發(fā)、改善患者臨床癥狀、延長(zhǎng)生存時(shí)間和提高生活質(zhì)量具有重要意義。
　　第一章節(jié)結(jié)

2、直腸癌組織中Gankyrin高表達(dá)
　　目的：從結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移出發(fā)，尋找潛在的能有效預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。
　　方法：首先通過The Cancer GenomeAtlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織樣本，篩選差異表達(dá)基因；然后采用免疫組織化學(xué)、Western Blot、酶聯(lián)吸附免疫印跡（ELISA）方法檢測(cè)我院結(jié)直腸癌患者樣本中Gankyrin表達(dá)水平；最后，Kaplan-Meier法分析Ga

3、nkyrin表達(dá)對(duì)CRC患者生存時(shí)間的影響。
　　結(jié)果：芯片結(jié)果顯示，相對(duì)于正常結(jié)直腸組織，人結(jié)直腸癌組織中有21個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(4倍以上，P<0.05)。其中，Gankyrin表達(dá)上調(diào)。免疫組化結(jié)果顯示，Gankyrin蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，在結(jié)直腸癌組織中Gankyrin表達(dá)高于正常組織；Gankyrin表達(dá)強(qiáng)度隨著臨床分期的升高而升高。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC組織Gankyrin表達(dá)高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC組織。Werstern

4、 Blot結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中Gankyrin蛋白高表達(dá)，而在癌旁組織及正常組織中Gankyrin蛋白表達(dá)量較低。ELISA結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血漿中 Gankyrin的表達(dá)高于健康人。生存分析顯示，Gankyrin高表達(dá)的CRC患者預(yù)后不良，5年總生存率減低。
　　結(jié)論：
　　①結(jié)直腸癌組織中Gankyrin表達(dá)高于正常結(jié)直腸組織。
　?、贕ankyrin在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度隨著結(jié)直腸癌Dukes分

5、期的增加而增強(qiáng)；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC組織中Gankyrin表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移的CRC組織。
　?、跥ankyrin高表達(dá)的CRC患者預(yù)后不良，5年總生存率減低。
　　第二章節(jié) Gankyrin促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
　　目的：體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Gankyrin促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。
　　方法：
　　①構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)Gankyrin、干擾Gankyrin的CRC細(xì)胞。
　?、隗w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

6、Gankyrin對(duì)CRC增殖、遷移和侵襲的影響。
　?、鄯肿铀缴向?yàn)證Gankyrin誘導(dǎo)CRC細(xì)胞發(fā)生 EMT。
　　結(jié)果：
　　①成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)Gankyrin和干擾Gankyrin的CRC細(xì)胞株。
　?、谂c對(duì)照組CRC細(xì)胞相比，過表達(dá)Gankyrin組生長(zhǎng)速度快，細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)，G1期細(xì)胞比例減少，而G2期和S期細(xì)胞比例增加；與對(duì)照組CRC細(xì)胞相比，穩(wěn)定干擾Gankyrin組生長(zhǎng)速度慢，細(xì)胞克隆形

7、成能力降低，G1期細(xì)胞比例增加，而G2期和S期細(xì)胞比例減少。
　?、踂estern Blot結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，過表達(dá)Gankyrin的CRC細(xì)胞，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Fibronectin和Vimentin的蛋白表達(dá)增加；干擾Gankyrin則E-cadherin的蛋白表達(dá)增加， Fibronectin和 Vimentin的蛋白表達(dá)減少。
　　結(jié)論：
　?、龠^表達(dá)Ga

8、nkyrin增強(qiáng)CRC細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力，而干擾Gankyrin表達(dá)則減弱CRC細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。
　?、贕ankyrin通過促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)程，增加S期比例，增強(qiáng)體外增殖能力。
　?、跥ankyrin誘導(dǎo) EMT的發(fā)生，增強(qiáng)CRC細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。
　　第三章節(jié) Gankyrin激活PI3K/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路
　　目的：進(jìn)一步探索研究 Gankyrin促進(jìn)結(jié)直腸

9、癌肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　方法：
　?、倩蛐酒夹g(shù)篩選SW480-Gankyrin、SW480-Vector細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，挖掘可能的作用機(jī)制。
　?、诜肿铀綑z測(cè)并驗(yàn)證信號(hào)通路機(jī)制。
　?、垠w內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證干擾Gankyrin抑制CRC細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：
　　①生物信息學(xué)GSEA分析發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)Gankyrin使AKT和GSK-3β/β-catenin通

10、路分子富集，調(diào)控GSK-3β/β-catenin通路下游18個(gè)關(guān)鍵基因。Ingenuity Pathway分析發(fā)現(xiàn)Gankyrin調(diào)控了以β-catenin為中心的GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)。
　　②Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過表達(dá)Gankyirn能下調(diào)PTEN、P21蛋白表達(dá)，上調(diào)p-AKT（ser473）、p-GSK3β（ser9）、β-catenin、CyclinD1, c-myc和

11、MMP-7的蛋白表達(dá)，總AKT和總GSK3β表達(dá)不變。干擾Gankyirn上調(diào)PTEN、P21蛋白表達(dá)，下調(diào)p-AKT（ser473）、p-GSK3β（ser9）、β-catenin、CyclinD1, c-myc和MMP-7的蛋白表達(dá)，總AKT和總GSK3β表達(dá)不變。PI3K活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照細(xì)胞比較，過表達(dá)Gankyrin的CRC細(xì)胞中PI(3,4,5)P3和 PI(3,4)P2水平提高，而干擾Gankyrin后PI(3,

12、4,5)P3和PI(3,4)P2水平降低。AKT活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞比較，過表達(dá)Gankyrin的CRC細(xì)胞中AKT活性增強(qiáng)，而干擾Gankyrin的CRC細(xì)胞AKT活性減弱。TOP/FOP熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，過表達(dá) Gankyrin的 CRC細(xì)胞β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄激活活性增強(qiáng)；干擾 Gankyrin的 CRC細(xì)胞β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄激活活性減弱。Western Blot結(jié)果顯示，AKT抑制劑處理前，

13、過表達(dá)Gankyrin下調(diào)PTEN、P21，上調(diào)p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)、β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7蛋白表達(dá)，總 GSK3β、總AKT表達(dá)不變。AKT抑制劑處理后，過表達(dá)Gankyrin上調(diào)的p-GSK3β(Ser9)、β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7蛋白和下調(diào)P21蛋白表達(dá)均減弱。
　　③裸鼠 CRC肝轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示干擾 Gankyri

14、n組腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移較對(duì)照組弱。干擾組肝臟表面轉(zhuǎn)移灶少于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　①Gankyrin激活了PI3K/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路。
　?、诟蓴_Gankyrin減弱CRC細(xì)胞體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移能力。
　　全文結(jié)論：Gankyrin作為一種原癌基因，在結(jié)直腸癌中促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，高表達(dá)Gankyrin預(yù)后不良。Gankyrin通過促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)程增加S期比例，增強(qiáng)體外增殖能力；通過激活PI3K/ GSK