Gankyrin促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子作用機制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（CRC）是世界上第三大癌癥，致死率極高。約25％的病人被診斷時發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，而另外約25%的患者在早期診斷中雖未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，但最終會發(fā)展為肝轉(zhuǎn)移。其發(fā)生肝轉(zhuǎn)移是死亡率高的一個重要原因，隨著對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移研究的深入，一些信號分子成為研發(fā)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移藥物的潛在靶標。因此，深入研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)機制，發(fā)現(xiàn)有效的調(diào)控分子和信號轉(zhuǎn)導途徑，對于藥物研發(fā)、改善患者臨床癥狀、延長生存時間和提高生活質(zhì)量具有重要意義。
　　第一章節(jié)結(jié)

2、直腸癌組織中Gankyrin高表達
　　目的：從結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移出發(fā)，尋找潛在的能有效預測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子標志物。
　　方法：首先通過The Cancer GenomeAtlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫比對結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織樣本，篩選差異表達基因；然后采用免疫組織化學、Western Blot、酶聯(lián)吸附免疫印跡（ELISA）方法檢測我院結(jié)直腸癌患者樣本中Gankyrin表達水平；最后，Kaplan-Meier法分析Ga

3、nkyrin表達對CRC患者生存時間的影響。
　　結(jié)果：芯片結(jié)果顯示，相對于正常結(jié)直腸組織，人結(jié)直腸癌組織中有21個基因表達上調(diào)(4倍以上，P<0.05)。其中，Gankyrin表達上調(diào)。免疫組化結(jié)果顯示，Gankyrin蛋白表達主要定位于細胞膜，在結(jié)直腸癌組織中Gankyrin表達高于正常組織；Gankyrin表達強度隨著臨床分期的升高而升高。有遠處轉(zhuǎn)移的CRC組織Gankyrin表達高于無遠處轉(zhuǎn)移的CRC組織。Werstern

4、 Blot結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中Gankyrin蛋白高表達，而在癌旁組織及正常組織中Gankyrin蛋白表達量較低。ELISA結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血漿中 Gankyrin的表達高于健康人。生存分析顯示，Gankyrin高表達的CRC患者預后不良，5年總生存率減低。
　　結(jié)論：
　?、俳Y(jié)直腸癌組織中Gankyrin表達高于正常結(jié)直腸組織。
　?、贕ankyrin在結(jié)直腸癌中呈高表達，且表達強度隨著結(jié)直腸癌Dukes分

5、期的增加而增強；有遠處轉(zhuǎn)移的CRC組織中Gankyrin表達高于無轉(zhuǎn)移的CRC組織。
　?、跥ankyrin高表達的CRC患者預后不良，5年總生存率減低。
　　第二章節(jié) Gankyrin促進結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲
　　目的：體外細胞實驗驗證Gankyrin促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲。
　　方法：
　?、贅?gòu)建穩(wěn)定過表達Gankyrin、干擾Gankyrin的CRC細胞。
　?、隗w外細胞實驗驗證

6、Gankyrin對CRC增殖、遷移和侵襲的影響。
　?、鄯肿铀缴向炞CGankyrin誘導CRC細胞發(fā)生 EMT。
　　結(jié)果：
　?、俪晒?gòu)建穩(wěn)定過表達Gankyrin和干擾Gankyrin的CRC細胞株。
　?、谂c對照組CRC細胞相比，過表達Gankyrin組生長速度快，細胞克隆形成能力增強，G1期細胞比例減少，而G2期和S期細胞比例增加；與對照組CRC細胞相比，穩(wěn)定干擾Gankyrin組生長速度慢，細胞克隆形

7、成能力降低，G1期細胞比例增加，而G2期和S期細胞比例減少。
　　③Western Blot結(jié)果顯示，相對于對照細胞，過表達Gankyrin的CRC細胞，上皮細胞標志物E-cadherin的蛋白表達減少，間質(zhì)細胞標志物Fibronectin和Vimentin的蛋白表達增加；干擾Gankyrin則E-cadherin的蛋白表達增加， Fibronectin和 Vimentin的蛋白表達減少。
　　結(jié)論：
　?、龠^表達Ga

8、nkyrin增強CRC細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力，而干擾Gankyrin表達則減弱CRC細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。
　?、贕ankyrin通過促進細胞進程，增加S期比例，增強體外增殖能力。
　　③Gankyrin誘導 EMT的發(fā)生，增強CRC細胞的體外遷移和侵襲能力。
　　第三章節(jié) Gankyrin激活PI3K/GSK3β/β-catenin信號通路
　　目的：進一步探索研究 Gankyrin促進結(jié)直腸

9、癌肝轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　方法：
　?、倩蛐酒夹g(shù)篩選SW480-Gankyrin、SW480-Vector細胞的差異基因表達譜，并進行生物信息學分析，挖掘可能的作用機制。
　?、诜肿铀綑z測并驗證信號通路機制。
　?、垠w內(nèi)動物實驗進一步驗證干擾Gankyrin抑制CRC細胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：
　?、偕镄畔WGSEA分析發(fā)現(xiàn)：過表達Gankyrin使AKT和GSK-3β/β-catenin通

10、路分子富集，調(diào)控GSK-3β/β-catenin通路下游18個關(guān)鍵基因。Ingenuity Pathway分析發(fā)現(xiàn)Gankyrin調(diào)控了以β-catenin為中心的GSK-3β/β-catenin信號通路網(wǎng)絡。
　?、赪estern Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達Gankyirn能下調(diào)PTEN、P21蛋白表達，上調(diào)p-AKT（ser473）、p-GSK3β（ser9）、β-catenin、CyclinD1, c-myc和

11、MMP-7的蛋白表達，總AKT和總GSK3β表達不變。干擾Gankyirn上調(diào)PTEN、P21蛋白表達，下調(diào)p-AKT（ser473）、p-GSK3β（ser9）、β-catenin、CyclinD1, c-myc和MMP-7的蛋白表達，總AKT和總GSK3β表達不變。PI3K活性檢測結(jié)果顯示，與空白對照細胞比較，過表達Gankyrin的CRC細胞中PI(3,4,5)P3和 PI(3,4)P2水平提高，而干擾Gankyrin后PI(3,

12、4,5)P3和PI(3,4)P2水平降低。AKT活性檢測結(jié)果顯示，與對照細胞比較，過表達Gankyrin的CRC細胞中AKT活性增強，而干擾Gankyrin的CRC細胞AKT活性減弱。TOP/FOP熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，過表達 Gankyrin的 CRC細胞β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄激活活性增強；干擾 Gankyrin的 CRC細胞β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄激活活性減弱。Western Blot結(jié)果顯示，AKT抑制劑處理前，

13、過表達Gankyrin下調(diào)PTEN、P21，上調(diào)p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)、β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7蛋白表達，總 GSK3β、總AKT表達不變。AKT抑制劑處理后，過表達Gankyrin上調(diào)的p-GSK3β(Ser9)、β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7蛋白和下調(diào)P21蛋白表達均減弱。
　?、勐闶?CRC肝轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示干擾 Gankyri

14、n組腫瘤生長和轉(zhuǎn)移較對照組弱。干擾組肝臟表面轉(zhuǎn)移灶少于對照組。
　　結(jié)論：
　?、貵ankyrin激活了PI3K/GSK3β/β-catenin信號通路。
　　②干擾Gankyrin減弱CRC細胞體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移能力。
　　全文結(jié)論：Gankyrin作為一種原癌基因，在結(jié)直腸癌中促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，高表達Gankyrin預后不良。Gankyrin通過促進細胞進程增加S期比例，增強體外增殖能力；通過激活PI3K/ GSK